高分辨基因分型的临床详解演示文稿

用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原癌基因进行基因分型RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。

RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。

一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA 染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。

此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。

主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。

主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。

主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。

设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。

这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。

对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。

用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。

多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。

MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。

RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。

之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。

但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。

其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。

高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。

在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。

方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。

样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。

除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。

在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。

结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。

发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。

我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。

用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。

我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。

结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。

在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。

stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。

self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。

弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。

依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。

tpmt基因分型TPMT基因分型与药物代谢相关的研究已经引起了广泛的关注。

TPMT 基因编码的酶是一种重要的药物代谢酶，参与对硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤以及一些抗癌药物的代谢。

不同基因型的个体对于药物的代谢能力有所不同，因此TPMT基因分型也被用作个体化用药的参考依据。

TPMT基因的分型主要包括三种：TPMT*1、TPMT*2和TPMT*3。

其中，TPMT*1是正常型，即正常的酶活性；TPMT*2和TPMT*3则是突变型，这两种突变型基因会导致酶活性降低或完全丧失。

根据不同的基因型，个体的药物代谢能力也存在差异，从而影响药物的疗效和安全性。

TPMT基因的分型对于临床用药有着重要的指导意义。

研究发现，TPMT*3A是最常见的突变型基因，约占白人的10%和亚洲人的3%。

携带TPMT*3A基因的患者对于硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的代谢能力明显降低，容易出现药物的毒副作用。

因此，在给这类患者使用这两种药物时，需要根据其基因分型来调整药物剂量，以避免不良反应的发生。

除了TPMT*3A以外，还有其他一些较为罕见的突变型基因，如TPMT*2和TPMT*3C。

这些基因的突变也会导致酶活性的下降，从而影响药物的代谢。

因此，在用药前对患者进行TPMT基因的检测，可以帮助医生评估患者的药物代谢能力，从而制定个体化的用药方案。

TPMT基因分型在临床上的应用不仅限于对硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的用药调整，还可以用于其他一些抗癌药物的个体化用药。

例如，6-巯基嘌呤是一种常用的抗癌药物，其在体内的代谢过程中需要依赖TPMT酶的参与。

因此，对于患有突变型TPMT基因的患者，使用6-巯基嘌呤时需要减少剂量或选择其他的治疗方案，以避免药物的毒副作用。

除了对药物代谢的影响外，TPMT基因分型还与一些自身免疫疾病的发生有关。

研究发现，携带TPMT*3C基因的个体在使用硫唑嘌呤等药物时，容易出现骨髓抑制等不良反应，进而增加自身免疫疾病的风险。

因此，在给这类患者用药时，需要谨慎选择药物并调整剂量，以减少不良反应的发生。

hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。

其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。

通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。

高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。

它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。

这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。

高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。

2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。

3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。

荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。

4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。

通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。

5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。

根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。

高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。

在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。

在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。

而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。

除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。

通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。

总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。

基于第二代测序技术的hla高分辨分型检测标准深圳市标准化指导性技术文件基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测标准编制说明(征求意见稿)《基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测标准》编制组2013--××--××一、任务来源深圳市标准化指导性技术文件《基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测标准》由深圳市市场监督管理局2013年批准立项，由深圳华大基因健康科技有限公司和深圳华大临床检验中心联合起草。

本项任务由深圳市卫生和人口计划生育委员会归口。

二、目的和意义HLA高分辨分型技术是世界卫生组织(WHO)认定的HLA分型标准。

基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测技术，只需通过一次实验就能够读取约16000份样本的HLA序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可发现新的等位基因。

在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。

为使基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测技术更广泛地推广使用，深圳华大基因健康科技有限公司和深圳华大临床检验中心联合起草本标准，以期规范基于第二代测序技术的HLA 高分辨分型检测，更好地服务社会。

同时，采用第二代测序技术进行HLA高分辨分型检测，可带来显著的经济和社会效益。

近年来随着新一代测序技术快速发展，测序成本不断降低而测序通量大大提高。

基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测技术，是一种值得推广的技术。

其通量高、成本低、配型精确且快速，真正做到了“低分价格，高分数据”，可从根本上减少患者家庭和社会的经济负担，同时也可为治疗争取宝贵的时间，为家庭稳定、社会和谐提供良好保障。

三、编制原则及技术依据(一) 编制原则充分考虑基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测的技术水平及发展趋势，既要突出体现标准的“科学性”、“前瞻性”和“先进性”，也要结合深圳本地实际情况，考虑标准的“适用性”和“通用性”。

(二) 技术依据1. 按照GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则第一部分:标准的结构和编写规则》及GB/T 1.2-2002《标准化工作导则第二部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》的要求进行编写。

赛福基因公开课第六节《高通量数据分析中变异基本操作和注释分析》大家好，我是付凤丽。

很高兴今天又有机会和大家一起探讨生物信息学的知识。

在赛福基因第五讲，我们介绍了如何从全外显子测序数据中分析识别出SNP和INDEL变异。

这些变异保存在VCF格式的文件中。

今天我们来介绍一些对VCF文件的基本操作，以及如何对变异进行评估、注释和筛选，进而来回答相应的生物学问题。

今天介绍的内容包括：一些基本的VCF文件的操作，等位位点的相位分析以及变异的注释和筛选。

第一部分：基本的VCF文件操作。

在得到VCF文件之后，有时候我们需要对VCF文件进行操作来得到我们需要的变异集。

比如，为了得到更可靠的变异，我们可能用不同的变异软件对同一个样品进行变异识别，然后从两个变异文件中找出共同的变异；或者，我们需要查看不同样品间，相同的变异和不同的变异分别是什么；又或者，我们想找出我们的样品里独有的变异等等。

这些任务都可以通过对VCF的基本操作来完成。

下面我们介绍两个GATK里实现类似功能的软件。

GATK的Select Variants可以用来选择VCF里符合特定条件的变异子集。

特定的条件用-select来定义。

如果要从一个含有很多样品的VCF里选取部分样品的变异子集，用-sn(单个样品名），-sf（含多个样品名的文件）或者-se（符合特定条件的样品名字）来定义。

另外还有一些参数来设定变异的去留。

在默认选项里，SelectVariants只是对变异加上通过过滤条件或者未通过过滤条件的标示，并不将不符合条件的变异去除，如果只想保留符合过条件的变异，使用-ef （excludeFilteredVariants）参数。

当从多个多个样品的VCF里选取部分样品时，会出现一些对选定的样品来说都没有变异的位点，可以用参数-env(excludeNonVariants)去除这些位点。

比如说我们想看看来自于1000genome的变异里有多少来自于欧洲人群时，可以用SelectVariants软件，把欧洲人样品名全部列在一个文件里提供给参数--sample_file （-sf），同时用--exclude Filtered(-ef) 和--excudeNonVariants (-evn) 来去除来自于非欧洲人的变异。

NTM基因分型1. 介绍NTM（非结核分枝杆菌）是一类与结核分枝杆菌（TB）有关的细菌。

与TB不同，NTM在人类体内引起的感染相对较少见，但它们可以导致一系列疾病，包括肺部感染、淋巴结炎、皮肤感染和器官感染等。

NTM感染通常发生在免疫功能低下的患者身上，比如艾滋病患者、免疫抑制剂使用者等。

NTM菌株之间存在很大的遗传多样性，不同的菌株可能在致病性和耐药性方面有所差异。

因此，对NTM进行基因分型可以帮助我们更好地了解其流行病学特征、致病机制以及药物治疗方面的选择。

2. 基因分型方法目前，常用的NTM基因分型方法主要包括PCR-RFLP、多重引物扩增序列分析（MLPA）、多重引物扩增DNA指纹分析（MIRU-VNTR）和全基因组测序等。

2.1 PCR-RFLPPCR-RFLP是一种简单且经济的基因分型方法。

它通过PCR扩增特定基因片段，然后使用限制性内切酶对PCR产物进行切割，最后通过凝胶电泳分析切割产物的长度差异。

这种方法可以快速鉴定NTM的物种和亚种。

2.2 MLPAMLPA是一种基于PCR的方法，它使用多个引物对目标基因进行扩增，并通过引物的序列信息来确定菌株的遗传多样性。

MLPA可以同时检测多个基因，从而提高检测的准确性和灵敏度。

2.3 MIRU-VNTRMIRU-VNTR是一种基于PCR的方法，它使用多个引物对菌株的特定基因片段进行扩增，并通过扩增产物的长度差异来识别不同的菌株。

MIRU-VNTR是一种高分辨率的分型方法，可以用于研究不同菌株之间的遗传关系和传播途径。

2.4 全基因组测序全基因组测序是一种最新的基因分型方法，它可以对菌株的整个基因组进行测序，并通过比对不同菌株的基因组序列来确定它们之间的遗传关系。

全基因组测序可以提供最详细的基因分型信息，但由于其高成本和复杂性，目前在实际应用中还比较有限。

3. 应用和意义NTM基因分型的应用和意义主要表现在以下几个方面：3.1 流行病学研究通过对不同地理区域和不同时间点的NTM菌株进行基因分型，可以了解NTM感染的流行趋势和传播途径。