Hsp90和真菌耐药性
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Hsp90和真菌耐药性陈怡1 戈梅2 陈代杰3*（1 上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2 上海来益生物药物研究开发中心，上海 201203；3 上海医药工业研究院，上海 200040）摘要： 近年来的研究发现，热休克蛋白90（Hsp90）作为一种高分子量的分子伴侣，不仅可以辅助胞内蛋白质的折叠和转运，还可以调节细胞内的信号传导，增强微生物细胞的耐药性。
本文主要就Hsp90的结构、功能、使真菌产生耐药性的作用机制，和Hsp90抑制剂的研究进展等方面进行了综述。
关键词： Hsp90；真菌耐药性；Hsp90抑制剂中图分类号： Q935 文献标识码： AHsp90 and fungal resistanceChen Yi 1, Ge Mei 2 and Chen Dai-jie 3(1 College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234; 2 Shanghai Health Creation Center forBiopharmaceuticals R&D, Shanghai 201203; 3 Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040)Abstract Some studies in recent years have revealed that heat shock protein 90(Hsp90), as a kind of molecular chaperones with high molecular weight, could not only assist the folding and transporting of intracellular protein, but also regulate intracellular signal transmission, and enhance the resistance of microbe cells. This article brie fl y reviews the Hsp90 in terms of structure, function, mechanism generating fungi resistance, and recent progress on Hsp90 inhibitors.Key words Hsp90; Fungal resistance; Hsp90 inhibitors收稿日期：2009-06-05作者简介：陈怡，女，生于1985年，在读硕士研究生，研究方向为微生物药物学。
*通讯作者，Email ：hccb001@163. com文章编号：1001-8689（2010）02-0087-04近年来，随着抗生素药物的滥用，出现了越来越多的耐药菌，例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA ），耐青霉素肺炎链球菌（PRSP ）、耐万古霉素肠球菌（VRE ）等，细菌耐药性问题已经成为了一个研究热点。
与细菌耐药性一样，随着肿瘤化疗和艾滋病患者的不断增多，真菌感染，尤其是深部真菌感染病症不断地增多，抗真菌药物大量的使用，使得真菌耐药性问题日趋严重。
真菌耐药性和细菌耐药性相似，存在着特异性和非特异性耐药两种机制。
前者主要是真菌细胞产生某种钝化酶来特异性地修饰或破坏抗真菌药物的分子结构，或是某种抗生素的作用靶位发生改变致使两者的亲和力降低的作用机制；后者是诸如外排泵和Hsp90介导的无抗生素结构特异性的耐药机制。
本文简要阐述Hsp90介导的非特异性真菌耐药机制。
1 热休克蛋白家族简介1962年，意大利生物学家Ritossa 在研究果蝇(Drosophila )发育时发现，当培养果蝇的温度超出正常生理水平时，幼虫(larvae)细胞中一些巨型染色体上的位点就会变得异常活跃。
研究表明，温度升高促使了一些新基因的表达。
这就是热激反应（heat-shock response)的发现。
1974年Tissieres 等从高温环境下果蝇幼虫的唾液、脑和马尔皮基式管中分离得到几种新的蛋白。
通过进一步试验证实，高温环境可以激发一组特殊蛋白质的合成，这种特殊的蛋白质就被称为热休克蛋白（Heat shock protein, HSPs）。
按照分子质量大小，可被分为六大家族，即Hsp110（104~170KD）、Hsp90（83~96KD）、Hsp70（66~78KD）、Hsp60（58~65KD）、Hsp40（32~47KD）、sHsp（10~28KD）[1]。
2Hsp90结构与功能Hsp90是一类Mr 90×103的热休克蛋白，主要存在于细胞内，在细胞内发挥分子伴侣的功能，帮助蛋白质的正确折叠。
Hsp90可抑制新生肽链的不正确折叠，或去除肽链的错误折叠。
Hsp90在胞内有Hsp90 和Hsp90 两种形式，他们分别以同源二聚体的形式存在。
Hsp90 和Hsp90 分别含有731个氨基酸和723个氨基酸，Hsp90 主要存在于大脑和睾丸中，Hsp90 主要存在于外周组织中，Hsp90 在热诱导的条件下产生，Hsp90 在生长因子诱导的条件下产生。
它们都是细胞正常生长所必需的蛋白质，两者缺一不可。
Hsp90的二聚体结构单体由N端，C端，和中间的铰链部分组成[2]。
N端具有ATP/ADP结合位点、核苷酸结合位点和靶蛋白结合位点。
C端也含有一个核苷酸结合位点，但亲和力较小，另外，还有一个钙调蛋白结合位点。
Hsp90在细胞内的功能非常丰富，首先，它可调控细胞周期；其次，Hsp90具有免疫调节作用，Matthews 等的研究[3]发现，Hsp90在白色念球菌内是其免疫优势抗原；第三，Hsp90在胞内有转运蛋白的功能，它可以辅助蛋白质的折叠，同时也具有将错误折叠的蛋白质去除、转运出细胞的功能；第四，Hsp90可调控胞内信号传导，本文将着重介绍这一功能与微生物耐药性之间的关系。
3Hsp90介导的真菌耐药机制微生物耐药性的形成是体内调控的结果，近年来，有些研究者发现，Hsp90可调节微生物体内蛋白，保护细胞活性，它在形成真菌耐药性的过程中，发挥了重要的作用(Fig.1)。
由Fig.1可见，a：在正常的生理状态下，真菌细胞膜上有麦角固醇；b：吡咯抗真菌剂（例如，氟康唑）抑制ERG11基因，阻碍麦角固醇的合成，这导致了一种毒性固醇中间体的累积，破坏了细胞膜的完整性。
Hsp90伴随着钙调神经磷酸酶（calcineu-rin），形成了信号转导网络，该网络是形成和维持耐药性所必需的；c: Hsp90抑制剂（如geldanamycin）或者钙调神经磷酸酶抑制剂（例如，FK506）阻碍这些信号网络的形成，可防止耐药性的产生，一旦耐药性产生，也能将其消除。
Hsp90在热应激条件下大量表达，增强细胞的抗逆性，使细胞表现出耐药性。
在耐药性的形成过程中，Hsp90并不是单独存在并发挥作用的，相反，它与许多蛋白结合，共同完成了耐药性的形成。
在真核细胞中，已发现100多种受Hsp90调节的蛋白，他们也可被称为Hsp90的客户蛋白（client protein）。
这些蛋白和HSP90共同进入一个以Hsp90和Hsp70为主的分子伴侣复合体，完成信号转导作用。
Pratt等利用网织红细胞裂解物培养体系，重组了类固醇激素受体和Hsp90分子伴侣复合体[4]。
Hsp90分子伴侣复合体体系是一个由5种蛋白组成的系统，这5种蛋白包括Hsp90，Hsp70，Hop，Hsp40，p23。
Hsp70和Hsp40先相互作用，并与类固醇激素受体结合，接着，这个复合体又与Hsp90，Hop，p23结合。
在该过程中，类固醇激素受体处于折叠状态时，它的配体结合结构域（ligand binding domain，LBD）是关闭的，类固醇激素不能进入受体。
受体和激素的结合必须要有Hsp90的存在，所以，类固醇激素在未活化之前都和HSP90结合在一起。
受体与Hsp90结合以后，Hsp90依赖ATP水解，从而改变了类固醇受体的构象，将LBD打开，使类固醇激素进入了受体[5]。
在LBD打开的状态下，p23起到了稳定构象的作用，Hop被释放。
Cowen等以S. cerevisiae为模板，将geldanamycin （GA）或根赤壳菌素（radicicol，RD）作为Hsp90蛋白N端的抑制剂，来考察Hsp90在微生物耐药性形成过程中的作用[6]。
Geldanamycin或radicicol与Hsp90蛋白N末端特异性结合，可抑制Hsp90的活性，使客户蛋白不能与Hsp90结合。
以类固醇激素受体为例，geldanamycin Fig.1The function of Hsp90 in antifungal drug resistance或radicicol和Hsp90蛋白N末端结合，Hsp90活性被抑制，且类固醇激素受体和Hsp90分离，类固醇激素就无法与受体结合，LBD就不能打开，激素就不能进入受体，不能引发一系列信号传导反应，此时的细胞处于无防备状态，对于外界药物的刺激没有耐受能力。
因此，如果能够抑制Hsp90的活性，使类固醇激素受体和类固醇激素不能结合，就能够达到抑制微生物细胞生长目的。
Hsp90分子伴侣复合体通过改变类固醇激素受体的构象，调节细胞的信号传导途径，提高细胞对外界刺激的随机应变能力，使微生物体细胞的存活能力增强，对抗菌药物的耐受性也随之增强。
Hsp90在细胞体内有自我调控能力，当受到刺激时，Hsp90的表达会大量增加，产生这一现象的原因主要是结合在Hsp90基因启动子上游的一段HSE(heat shock element)，其上含有HSF(heat shock factor)结合单位[7]。
正常情况下，HSF在胞内以单体状态存在，应激状况产生的时候，它们以三聚体形式在核内聚集，并与HSE结合，启动Hsp90基因的转录。
在人体细胞内，还存在着一种Hsp90负调控机制。
正常状态下，Hsp90和HSF结合，并抑制HSF活性，同时Hsp90和热损伤蛋白也有很强的亲和力，因此HSF 和热损伤蛋白之间存在着竞争性抑制。
在应激状态下，细胞内的热损伤蛋白增多，它们与Hsp90结合的机会增多，这就使得Hsp90与HSF结合机会减少，细胞内Hsp90-HSF复合物解离，游离的HSF增多，大量的HSF和HSE结合，启动了Hsp90的转录，产生了大量的Hsp90。
Cowen等的研究显示[2]，胞内Hsp90含量越多，真菌耐药性越强，这种耐药性的产生需要Hsp90的存在，如果Hsp90缺失，耐药性也随之消失。
