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双水相萃取糖化酶一、实验目的1、了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用与意义，及其与传统溶媒萃取技术的异同。
2、加深对分配系数K 、相比R 、收率Y 等基本概念的认识及相图的制作，掌握液液萃取中基本实验技术。
二、实验原理双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Cb/Ct ）。
在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，通过大量实验研究可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。
糖化酶亦称淀粉α-1，4葡萄糖苷酶。
这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端顺次切开α-1，4糖苷键，生成葡萄糖。
它们也能作用于支链淀粉的α-1，6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。
本实验选用PEG400-(NH4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。
表观分配系数bt C C K =相比bt V V R =收率RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+==1上、下相酶总量上相酶总量式中: C b 、C t 分别为下、上相酶浓度（活性）；V b 、V t 分别为下相、上相的体积。
物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积+下相酶活×下相体积三、实验仪器与药品仪器：天平 恒温水浴 离心机 液相混合器 刻度试管 吸管 酸式滴定管等 药品：糖化酶 PEG400、(NH 4)2SO 4、2%可溶性淀粉、0.15M NaOH 、1M H 2SO 4四、实验步骤（一）、PEG400-(NH 4)2SO 4双水相系统相图的制作1.配制40％的硫酸铵溶液（已经配好）。
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
实验二双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求1掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。
2了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。
3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸铵体系双水相萃取实验操作。
4明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。
二、实验器材和试剂1. 实验器材 :低速离心机;酸度计;涡流混合器;分光光度计2. 实验试剂 :PEG :(分子量分别为 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸铵、α-淀粉酶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛,最常采用的双水相体系是 PEG/Dex 或 PEG/低分子盐系统, 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。
T 为上相浓度, B 为下相浓度 , C 为系统临界点, TCB 为临界线或双节线,双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。
因此两相浓度要足够高才可以形成两相。
双水相萃取分配系数 K=Ct /Cb ,为上相和下相的浓度比。
双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。
利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。
相图中 TMB 为系线,其长度由相组成的总浓度决定,表征两相差异程度。
在临界点附近系线长度趋近于零,表示上相和下相的组成相同,因此分配系数应为 1。
随着 PEG 、硫酸铵和盐浓度增大,系线长度增加,上相和下相相对组成的差别就增加,酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。
本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配,具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。
双水相萃取糖化酶一、实验目的1、了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用与意义，及其与传统溶媒萃取技术的异同。
2、加深对分配系数K 、相比R 、收率Y 等基本概念的认识及相图的制作，掌握液液萃取中基本实验技术。
二、实验原理双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Cb/Ct ）。
在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，通过大量实验研究可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。
糖化酶亦称淀粉α-1，4葡萄糖苷酶。
这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端顺次切开α-1，4糖苷键，生成葡萄糖。
它们也能作用于支链淀粉的α-1，6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。
本实验选用PEG400-(NH4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。
表观分配系数bt C C K =相比bt V V R =收率RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+==1上、下相酶总量上相酶总量式中: C b 、C t 分别为下、上相酶浓度（活性）；V b 、V t 分别为下相、上相的体积。
物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积+下相酶活×下相体积三、实验仪器与药品仪器：天平 恒温水浴 离心机 液相混合器 刻度试管 吸管 酸式滴定管等 药品：糖化酶 PEG400、(NH 4)2SO 4、2%可溶性淀粉、0.15M NaOH 、1M H 2SO 4四、实验步骤（一）、PEG400-(NH 4)2SO 4双水相系统相图的制作1.配制40％的硫酸铵溶液（已经配好）。
一、双水相系统的相图绘制
1.实验目的
了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。
2.实验原理
相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。
曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。
结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。
组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。
图1 A-B-水双水相体系相图
Figure 1 The phase diagram of the A-B-H2O aqueous two-phase system 3.实验器材和试剂
（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。
（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。
4.操作方法
（1）溶液的配制
配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液
配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。
（2）相图的制作
精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。
记录盐溶液的加量(g)。
然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。
计算每次达到浑浊
时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
表1相图制作表
编
号水/g
(NH4)2SO4溶
液加量/g
纯(NH4)2SO4累
计量/g
溶液累计总量
/g
(NH4)2SO4质量分
数/%
PEG 质量
分数/%
1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79
2 0.
3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02
3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26
4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65
5 0.5 6.0769 4.7 19.327
6 24.52 1.08
6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8
7 0.5 6.8585 8.5 33.4596 25.32 0.62
根据以上数据以(NH4)2SO4质量分数为横坐标，以PEG质量分数为纵坐标即可做出相图。
二、双水相系统比例的选择
根据相图，选择五个成相比例。
三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin酚法或紫外分光光度法
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1．原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2．试剂和溶液
2.1 三氯乙酸c=0.4mol/L：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
2.3 盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1mol/L HCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液
a.磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）
0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b.乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c.硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
2.5 10g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
2.6 100ug/mL L-酪氨酸标准溶液
a．称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b．吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。
此溶液在冰箱内贮存或立即使用。
3.仪器和设备
3.1 恒温水浴40±0.2℃。
3.2 紫外分光光度计
4 分析步骤
4.1 求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。
4.2 测定
吸取适量稀释的酶液 2.00mL、酪素 2.00mL、三氯乙酸 4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。
滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）
加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL
40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心
于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。
标准曲线作同样处理。
5 计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。
所得结果表示至整数。
6 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3％。
四、双水相系统在蛋白酶分离中的应用
利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化，确定一个最佳分离体系。
1.向干燥的离心管中按比例加入一定质量PEG和盐溶液，先用玻璃棒搅匀，再在混合器上混匀，加入2mL的酶液，在混合器上混合，调pH，静置15分钟，离心10分钟(2000r/min)。
2.读取上下相体积及总体积，用1mL注射器分别取上、下相1mL，分别定容至100mL，测其酶活力。
3.测原酶液酶活力：用移液管吸取1mL发酵液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液酶活力。
