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苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择常明;孙启宏;周顺桂;倪晋仁【期刊名称】《生态环境学报》【年(卷),期】2010(026)006【摘要】化学杀虫剂的长期使用给生态环境造成了严重破坏,也使害虫种群的抗药性日益提高,生物杀虫剂以其"绿色环保"的特点引起人们的广泛关注.其中,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)制剂是目前世界上产最最大、应用最广的生物杀虫剂.它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等许多有害昆虫有毒杀作用,而对人类、动物和农作物无害.长期以来,人们一直致力于苏云金芽孢杆菌发酵过程的研究.以期获得高毒效的生物杀虫剂产品.本文首先对苏云金芽孢杆菌发酵生产的各种影响因素进行了综合分析.将影响因素分为培养条件和培养基组分两类.得出最佳培养条件为温度:(30±1)℃,pH:7.0±0.1,搅拌速度:400～600 r·min-1,通气量:1:0.6～1.2(发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比).接种时间:对数期初;最佳培养基配比为碳氮比:8～10:1,无机盐含量:KH2PO4或K2HPO4为0.075%～0.2%;MgS04·7H2O为0.075%～0.3%;CaCO3为0.075%～0.15%;MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O各为0.002%.其次,对当前研究与工业化生产中的各种发酵工艺进行了评述,总结了现有发酵工艺的优缺点.在现有研究基础上,降低培养基原料成本、改进发酵工艺和采用基因学手段构建高效工程菌株将成为未来研究热点.【总页数】7页(P1471-1477)【作者】常明;孙启宏;周顺桂;倪晋仁【作者单位】中国环境科学研究院,北京100012;北京大学环境工程系//教育部水沙科学重点实验室,北京100871;中国环境科学研究院,北京100012;广东省农业环境综合治理重点实验室//广东省生态环境与土壤研究所,广州510650;广东省农业环境综合治理重点实验室//广东省生态环境与土壤研究所,广州510650;北京大学环境工程系//教育部水沙科学重点实验室,北京100871【正文语种】中文【中图分类】X172【相关文献】1.利用黄水发酵生产生物发酵液的工艺研究 [J], 柴玉强;张宿义;霍丹群;侯长军;郑伟;敖宗华;秦辉2.生物发酵丙酸钙生产150m3发酵罐放大工艺摸索 [J], 徐艳力;3.利用味精废水生产苏云金芽孢杆菌生物农药Ⅱ:苏云金芽孢杆菌的菌种筛选及发酵优化 [J], 周晓兰;郑毅;邓春梅;余敏忠;林建华4.双菌株发酵生产苏云金杆菌生物杀虫剂的研究 [J], 李风萍;鲁玉峰5.餐饮废弃物生产微生物蛋白饲料发酵工艺的研究——发酵辅料的最适添加比例研究 [J], 孙时军;朱顺娣;李俊婷;赵陈锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
现代农业研究Modern Agriculture Research第26卷在农作物生产中，经常会发生虫害，与化学农药相比，微生物杀虫剂已成为全球农药产业发展的重点[1-2]。
其中苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其生长繁殖快，具有较强的适应性，易于人工培养，对直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等多种农业害虫有很强毒杀作用，是目前世界上应用最广的细菌性杀虫剂。
本试验对苏云金芽孢杆菌产芽孢的培养配方和培养条件进行优化，旨在为苏云金芽孢杆菌菌剂的生产提供理论依据。
1材料和方法1.1试验材料苏云金芽孢杆菌WY-197菌株，为吉林农业科技学院生物与制药工程学院微生物实验室保藏菌种；牛肉膏蛋白胨斜面试管培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，分装试管，常规灭菌后备用；液体菌种培养基：不加琼脂，装入250mL 三角瓶中，每瓶装入量100mL，常规灭菌后备用；碳源基础培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L；氮源基础培养基：葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L；无机盐基础培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L。
以上培养基调pH 值为7.4-7.6。
1.2培养条件的优化培养温度设25、30、35、37、40℃五个水平，培养72h；培养时间设24h、36h、48h、60h、72h 五个水平；培养基初始pH 值设6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五个水平。
对芽孢进行染色显微观察，对菌剂进行毒力测定，考查芽孢释放的最适培养温度、时间、pH 值。
1.3培养基质及配方的优化碳源、氮源、无机盐的单因素比较：在供试碳源基础培养基中，分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、马铃薯粉、玉米淀粉各10g/L；在供试氮源基础培养基中，分别加入酵母膏、蛋白胨、大豆（煮熟粉碎）、鱼粉（粉碎）、麦麸（粉碎）各10g/L；在供试无机盐基础培养基中，分别添加FeSO 4、KH 2PO 4、MgSO 4各4g/L，以及FeSO 42g/L+KH 2PO 42g/L、Fe-SO 42g/L+MgSO 42g/L、KH 2PO 42g/L+MgSO 42g/L。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，简称Bti）是一种广泛应用于生物农药领域的细菌，被广泛应用于蚊虫控制。
本文主要介绍苏云金芽孢杆菌的筛选方法及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌主要通过筛选分离或遗传改造获得。
筛选分离方法主要包括土壤样品采集、产孢核查、杀虫活性测定等步骤。
采集土壤样品，可以从湖泊、河流、池塘、沼泽等水源附近的土壤中采集，因为这些地方通常是蚊子孳生的地方。
然后，将土壤样品接种在含有适宜营养物质的培养基中，促使苏云金芽孢杆菌的生长。
接下来，通过形态学观察和生物学特性鉴定来确认是否获得了苏云金芽孢杆菌。
使用家蚊幼虫等蚊科昆虫幼虫进行杀虫活性测定，以评价苏云金芽孢杆菌的杀虫效果。
苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要通过其产生的杀虫晶体蛋白（Cry蛋白）实现。
这些Cry蛋白可以与蚊科幼虫的消化酶相互作用，破坏其肠道细胞膜，引起幼虫发生中毒死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫作用主要表现在以下几个方面：1. 快速杀虫：苏云金芽孢杆菌能迅速产生大量的Cry蛋白，只需几小时就可以导致蚊科幼虫死亡。
2. 高度选择性：苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白对蚊科幼虫具有强烈的杀虫活性，但对其他昆虫和动物没有明显杀伤作用。
3. 持久的杀虫效果：苏云金芽孢杆菌在水中具有较长的存活期，可以持续释放Cry蛋白，从而更好地控制蚊科幼虫的数量。
4. 不易产生抗药性：由于苏云金芽孢杆菌的杀虫机制是通过破坏肠道细胞膜导致幼虫死亡，而不是通过直接杀死昆虫的神经系统，因此不易产生抗药性。
苏云金芽孢杆菌是一种有效且安全的生物农药，可用于控制蚊科幼虫的数量。
它具有快速杀虫、高度选择性、持久的杀虫效果和不易产生抗药性等优点，对蚊虫的控制起到了积极的作用。
在蚊虫防控中，苏云金芽孢杆菌的应用前景广阔，但也需要在实际应用中不断完善其筛选方法和杀虫活性评估体系，提高其在蚊虫控制中的应用效果。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，简称Bti）是一种广泛应用于生物防治的杀虫菌株，特别适用于蚊科成虫和幼虫的控制。
本文将介绍苏云金芽孢杆菌的筛选方法以及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌的筛选通常是通过多步骤的实验流程进行的。
首先，需要收集环境中具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，可以是土壤、水体和其他环境样品。
然后，将这些样品分别进行细菌培养，通过高温杀菌等方法选择出富含苏云金芽孢杆菌的培养物。
接下来，将这些培养物进行纯化和鉴定，选择纯度高且效果好的苏云金芽孢杆菌菌株。
对于蚊科幼虫的杀虫活性测试，常采用生物学和生化学方法。
生物学方法包括黏贴法、培养沉降法、萤光健康法等。
这些方法通过将苏云金芽孢杆菌菌株与幼虫接触，观察幼虫的死亡情况以及菌株对幼虫的毒力大小。
生化学方法则是通过分析苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的毒杀机制，了解其杀虫活性的作用途径和影响因素。
研究表明，苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫具有较高的杀虫活性。
其主要作用机制是通过产生一种称为晶体蛋白（Cry）的毒素来杀死幼虫。
这种毒素进入幼虫消化系统后，被分泌的蛋白酶降解，释放出毒素结晶体，然后结晶体溶解并结合到幼虫肠道上皮细胞的受体上，导致细胞破裂和死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性受多种因素的影响，如菌株的纯度、菌液的浓度、幼虫的种类、菌株与幼虫的接触时间等。
一般来说，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性较高，对蚊科幼虫的毒力大，可以达到较好的防治效果。
总体而言，苏云金芽孢杆菌的筛选方法较为简单，其对蚊科幼虫的杀虫活性较高。
将苏云金芽孢杆菌应用于蚊虫的综合防控中，有助于减少农药的使用，保护生态环境，提高防控效果。
烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化Abstract：In order to screen the bacterial strains which have antagonistic effects on Phytophthora nicotianae and provide favorable resources for the biological control of tobacco black shank disease in Henan tobacco areas，the rhizosphere soil samples of healthy tobacco plants were collected from tobacco black shank disease nursery and eight bacterial strains were screened by confrontation culture method. Among them，the strain LB-9 had the strongest and stable inhibitory effect on P. nicotianae with a bacteriostatic rate of 60.6% and a broad spectrum. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by 16S rRNA gene sequencing analysis. The optimum fermentation medium，temperature，time and initial pH value of LB-9 were determined by single factor optimization test which has great significance to the development and application of biocontrol agents.Keywords：Phytophthora nicotianae; antagonistic bacteria; screening and identification; fermentation condition煙草黑胫病是我国烟草的主要根茎部病害，最早发生于黄淮烟区[1-3]，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，是烟叶毁灭性病害之一。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，被广泛应用于农业、环境和医疗等领域。
本文旨在探讨苏云金芽孢杆菌的筛选方法以及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
一、苏云金芽孢杆菌的筛选方法苏云金芽孢杆菌的筛选主要通过以下几个步骤进行：1. 采集土壤样品：苏云金芽孢杆菌广泛存在于土壤中，因此采集土壤样品是筛选的第一步。
可以选择具有丰富苏云金芽孢杆菌资源的农田、森林等地。
2. 分离纯菌株：将采集到的土壤样品进行稀释和均匀分布于培养基表面，利用拭子或铂丝在相应条件下培养，形成单菌落。
通过进行传代分离，最终得到纯菌株。
3. 筛选菌株：采用一系列不同的培养基和条件，如温度、pH值、营养物质组成等，筛选出具有较高活性和杀虫特性的苏云金芽孢杆菌菌株。
4. 评价活性：利用一定的方法和指标来评价苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性。
常用的方法包括计数存活率、计算致死浓度等。
二、苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫具有一定的杀虫活性，主要通过其产生的抗菌物质和代谢产物实现。
1. 抗菌物质：苏云金芽孢杆菌在生长过程中，会产生一类称为杀菌肽的抗菌物质。
这些抗菌物质具有广谱抗菌活性，可以对蚊科幼虫的生长和发育产生抑制作用。
2. 代谢产物：苏云金芽孢杆菌在生长过程中，还会产生一系列的有机酸、酶和其他代谢产物。
这些代谢产物可以对蚊科幼虫的生理和代谢过程产生干扰，从而导致其死亡。
3. 其他作用机制：苏云金芽孢杆菌还可以通过与蚊科幼虫共生的方式来抑制其生长。
菌株会在蚊科幼虫体内生长繁殖，释放出一些有害物质，导致蚊科幼虫死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性受到多种因素的影响，如菌株的鉴定和筛选结果、培养条件和培养基组成等。
在具体应用中，需要进行进一步的研究和优化，以提高苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫效果。
山 东 化 工 收稿日期：２０１９－０１－１５作者简介：李 梅（１９７３—），女，福建浦城人，助理工程师，主要从事菌种的培育工作。
苏云金芽胞杆菌生产菌种的筛选李 梅（浦城县投资开发公司，福建浦城 ３５３４００）摘要：苏云金芽胞杆菌生产菌种的斜面菌种的制备、菌种的初筛（用凝胶电泳法检测毒素蛋白）菌种的复筛（用生物检测毒力效价）。
关键词：苏云金芽胞杆菌；凝胶电泳法检测毒素蛋白；菌种初筛；菌种复筛；紫外线诱变；小菜蛾生物毒力测定中图分类号：Ｓ４７６＋．１１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）１１－００７６－０１ 苏云金芽胞杆菌简称Ｂｔ，它可以用于森林、棉花、玉米、蔬菜、水果以及茶、麻、烟叶等作物害虫，也可用于贮藏害虫和环境害虫的防治，对蔬菜、茶等害虫的防治效果达９０％以上，且符合国家食品Ａ级标准，是目前全世界公认明有效、最有前途的生物农药。
Ｂｔ是目前我国生产和销售量最大的一种生物杀虫剂。
Ｂｔ菌种在长期的生产过程中经常会出现退化导致减产，选育高产高效的生产菌种是每一个Ｂｔ生产单位菌种科室的首要任务。
本文以用凝胶电泳法检测毒素蛋白为初筛条件进行大量初筛，再以小菜蛾生物检测的效价进行复筛。
１ 材料和方法１．１ 菌种ＷＥ－２０１５－１。
１．２ 培养基肉汤培养基：牛肉膏６％、蛋白胨１０％、氯化钠０．１％、琼脂２％１．０ＭＰａ灭菌２０ｍｉｎ制成肉汤培养基３７℃培养２天后检查无杂菌，接入菌种培养２８℃两天制成出发菌种备用。
摇瓶培养基：花生粉１．０％、黄豆饼粉３．６％、淀粉：０．５％、酵母粉０．５％、硫酸镁０．１％、碳酸钙０．１％、氯化锌０．０５％、磷酸二氢钾０．１％１．０ＭＰａ灭菌３０ｍｉｎ。
１．３ 紫外线处理将培养好的肉汤菌种刮入装有生理盐水的平皿中，用功率１５Ｗ、波长２５６ｎｍ的紫外灯距离３０ｃｍ处照射１ｍｉｎ，然后进行稀释１０－８稀释自然分离，挑单菌落转入斜面培养。
１．４ 菌种初筛第一步初筛：将经过紫外线处理并经过自然分离的菌株培养于肉汤斜面２８℃培养２天，用品红染色液涂片染色镜检伴孢晶体的形态。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，以下简称Bti）是一种广泛应用于生物防治的杀虫剂，主要用于控制蚊子和其他蚊科昆虫的幼虫。
本文将介绍关于苏云金芽孢杆菌的筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
一、苏云金芽孢杆菌的筛选苏云金芽孢杆菌是一种土壤中常见的细菌，它产生的晶体蛋白对蚊科昆虫具有高度的毒力。
在苏云金芽孢杆菌中，主要的毒素是一种名为Cry4Aa的晶体蛋白，它对蚊科幼虫具有高度的选择性毒力。
苏云金芽孢杆菌的筛选通常是从天然环境中进行的。
研究人员采集不同产地的土壤样品，并通过稀释涂布法或筛选培养基对苏云金芽孢杆菌进行筛选。
经过筛选和鉴定，得到的苏云金芽孢杆菌菌株通常具有较高的杀虫活性和较好的稳定性，适合用于生产高效的杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性主要是通过其产生的Cry4Aa晶体蛋白发挥作用。
这种晶体蛋白具有特异的毒性作用，主要靶向蚊科幼虫的肠道细胞。
当蚊科幼虫摄入含有苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的培养基或溶液时，晶体蛋白会在其肠道中溶解，释放出活性毒素，并与肠道细胞表面的特定受体结合，导致细胞膜的破坏和细胞内环境的改变，最终引起蚊科幼虫的死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性具有很高的选择性，对其他昆虫和野生动物几乎没有毒性。
这主要是因为苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白靶向性强，只对蚊科幼虫的肠道细胞产生毒性作用，而对其他昆虫和野生动物的肠道细胞没有影响。
苏云金芽孢杆菌被广泛应用于蚊科幼虫的生物防治中，成为一种安全有效的杀虫剂。
在实际应用中，苏云金芽孢杆菌常用于蚊虫孳生的水体中进行喷施或喷洒。
因为苏云金芽孢杆菌可以在水中形成悬浮的颗粒，并且对水质和水体环境的变化不敏感，所以在水体中使用苏云金芽孢杆菌可以有效控制蚊虫的孳生，减少蚊虫的传播。
烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选杜雷;赵高岭;席宇;臧晓静;朱大恒【摘要】Using waste tobacco stem as raw material, the medium compositions and conditions of solid state fermentation for Bacillus thuringiensis HD-1 growth were optimized by orthogonal design and single factor experiments. The results showed that the optimal medium composition was: tobacco stem 88.13%,dusty yeast 1.17%,peptone1.17%,ground soybean cake 5.88%,corn flour2.93%,KH2PO40.18%,MgSO4·7H2O 0.24%, FeSO4 0.12% and MnSO4 0.18%. The best culture conditions were: inoculation concentration 6%,initial water content 65%,initial pH of the medium 7.5,under which sporulation stabilized at 9.5xl0-10CFU/g. It was feasible to produce Bacillus thuringiensis by solid state fermentation using waste tobacco stem as the main medium.%以烟草废料烟梗为培养基主要原料,采用正交和单因素试验方法,对苏云金芽孢杆菌HD-1菌株(Bacillus thuringiensis HD-1)的固态发酵培养基及培养条件进行了优化.结果表明,烟梗固态发酵培养基的最佳组合为:烟梗88.13％,酵母粉1.17％,蛋白胨1.17％,豆饼粉5.88％,玉米粉2.93％,KH2PO40.18％,MgSO4·7H2O0.24％,FeSO4 0.12％和MnSO4 0.18％；最佳培养条件为:接种量6％,初始含水率65％,初始pH7.5.在这种发酵条件下的产孢量可稳定在9.5×1010CFU/g.因此,利用烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌是可行的.【期刊名称】《烟草科技》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】4页(P69-72)【关键词】苏云金芽孢杆菌;固态发酵;正交设计;烟梗;产孢量【作者】杜雷;赵高岭;席宇;臧晓静;朱大恒【作者单位】郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001【正文语种】中文【中图分类】TS49苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上应用最为广泛的杀虫微生物，其发酵方法主要有液体深层发酵和固体浅盘发酵［1］。
目前大多数厂家使用的是液体深层发酵，但液体发酵需要昂贵的设备，浓缩和干燥耗能大，成本高，从而影响了生物农药的推广和应用。
固体发酵作为苏云金芽孢杆菌工业发酵的方法之一，与液体发酵相比在生产中逐渐体现出其优势，如废水、废渣少，环境污染少，能源消耗量低，工艺设备和技术较简单，投资低，并且产物浓度高，产品易保存，便于包装和运输［2］。
烟梗是烟草工业的副产物，我国每年约有数10万t 烟梗废弃物被弃置浪费［3］。
目前主要集中于打叶复烤厂内，不仅占用大量的仓库还需专人管理，如何对其充分利用已成为企业的迫切需求。
目前对烟梗的利用方法主要是制造梗丝和烟草薄片用于卷烟配方中，也有从烟梗中提取烟碱、茄尼醇、烟酸、果胶、植物蛋白等成分［4］的探索研究，但这些方法的利用量不大，每年仍有大量烟梗被废弃，造成自然资源的浪费。
烟梗中含有丰富的有机碳、氮和无机盐，是很好的发酵培养基质［5］。
目前用于苏云金芽孢杆菌固态发酵的原料主要是农副产品，大量生产相对成本比较高。
张怡等［6］将经处理后的废烟叶作为原料与麸皮混合作为载体，探索了固态发酵法培养苏云金芽孢杆菌的方法，但直接用烟梗为原料固态培养苏云金芽孢杆菌的研究尚未见报道。
为此，以烟梗为主要发酵原料，对培养基营养成分配比和发酵条件进行了优化，旨在探讨利用烟梗采用固态发酵法生产苏云金芽孢杆菌的可行性，以降低苏云金芽孢杆菌的生产成本，并为烟梗废料的综合利用开辟新途径。
1 材料与方法1.1 试验材料菌种：苏云金芽孢杆菌HD-1，商业菌种，本实验室保存。
烟梗由天昌国际烟草有限公司提供。
1.2 培养基斜面培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠20 g，琼脂20 g，水1000 mL；液体种子培养基：不加琼脂即可，在121℃灭菌20 min后备用。
筛选固体培养基：烟梗（粉碎过16目筛），玉米粉，豆饼粉（购于市场），蛋白胨（郑州创生），酵母粉（英国Oxoid公司），KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO4，MnSO4（天津市科密欧化学试剂开发中心）。
1.3 培养基成分的优化设计碳、氮源配比的优化：以烟梗为主要碳源，以蛋白胨、酵母粉、豆饼粉和玉米粉为补充氮源［7］，每个因素选高低4个水平进行正交试验设计［8］，应用L16（45）正交表对各组分进行优化试验，考察不同培养基组分对活芽孢数的影响。
各因素水平见表1。
无机盐优化：确定好碳、氮源配比后，将KH2PO4，FeSO4，（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O 4个因素作为培养基无机盐成分，每个因素选3个水平设计正交试验，应用L9（34）正交表对无机盐组分进行优化试验。
各因素水平见表2。
表1 培养基的碳、氮源正交试验水平Tab.1 Level of carbon and nitrogenresourcein medium（g）水平豆饼粉酵母粉0 0.2 0.4 0.6烟草废料10.0 12.5 15.0 17.5蛋白胨0 0.1 0.2 0.4 1 2 3 4 0 1 2 4玉米粉0 0.2 0.5 1表2 培养基的无机盐正交试验水平Tab.2 Level of inorganic saltin medium （g）水平1 2 3 KH2PO4 0.01 0.03 0.06 FeSO4 0.01 0.02 0.04 MnSO4 0.015 0.030.06 MgSO4·7H2O 0.02 0.04 0.061.4 三角瓶发酵培养按照正交试验设计，将各种配比的培养基配置好后装入250 mL的三角瓶，加水后摇匀，灭菌接种后培养。
培养过程中培养条件先按初始含水率60%，接种量5%，初始pH7.0，放入30℃培养箱培养，定时翻动摇匀培养基，并取样涂片、染色观察，至芽孢脱落率达到30%时终止培养，测其活芽孢数。
1.5 培养基条件的优化设计确定最优培养基营养成分组合后，用单因素试验方法，分别对接种量，培养基的初始pH，初始含水率进行优化。
1.6 分析方法采用孔雀绿及沙黄染色法观察芽孢的形成，平板菌计数法［9］对固体培养芽孢计数。
2 结果与讨论2.1 碳、氮源的优化结果根据表l正交试验设计对HD-1菌株进行固体发酵，结果表明（表3）：由极差R 可以看出，各因素对产孢量的影响为：烟草废料＞酵母粉＞玉米粉＞豆饼粉＞蛋白胨；烟梗固态发酵培养基的最佳组合为：烟梗15 g，酵母粉0.2 g，蛋白胨0.2 g，黄豆饼粉1 g，玉米粉0.5 g。
烟梗为菌体生长提供碳源，又是菌体生长的载体，且其含有丰富的糖类，很适宜作为发酵材料。
由表3可以看出，以蛋白胨为氮源对产芽孢数量影响不大，但以酵母粉、豆饼粉、玉米粉为补充氮源时影响较大，它们与烟梗混合，大大改善了培养基的发酵性能，提高了芽孢产率。
表3 L16（45）碳氮源优化正交试验设计与结果Tab.3 Designandresulto for thogonal test for optimizingcarbonandnitrogenresource注：①K为各因素水平产芽孢量的平均值；②R为极差；下同。
酵母粉蛋白胨豆饼粉玉米粉烟梗g 10 10 10 10 12.5 12.5 12.5 12.5 15 15 15 15 17.5 17.5 17.5 17.5 4.623 6.082 6.790 4.918 2.167 g0 g0 g0 0.2 0.5 11 0.5 0.2 0 0.2 01序号1234567891 0 0.5 0.5 10 11 12 13 14 15 16 g0124240142101042芽孢数/×1010CFU/g 2.33 6.83 5.33 4.00 5.00 7.17 6.33 5.83 6.00 6.50 7.83 6.83 5.50 6.00 3.50 4.67K1①K2K3K4 R②0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 4.707 6.625 5.748 5.332 1.918 0.1 0.2 0.4 0.1 0 0.4 0.2 0.2 0.4 0 0.1 0.4 0.2 0.1 0 5.500 5.540 5.790 5.582 0.290 5.373 6.498 5.375 5.168 1.330 0.2 4.5405.9576.207 5.707 1.6672.2 无机盐优化试验在菌体的生长中，许多矿质元素都直接参与细胞的组成、能量的转移、维持原生质的胶质体系和渗透性，对生长起着重要的作用。
其中Mg2+，Mn2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+的适当浓度对营养细胞的生长、芽孢和伴孢晶体的形成有明显刺激作用［8］。
由表4可以看出，KH2PO4的影响最显著，其次是MgSO4·7H2O，MnSO4和FeSO4的影响较小。
最佳无机盐配比为KH2PO40.03 g，FeSO40.02 g，MnSO40.03 g和MgSO4·7H2O 0.04 g。
2.3 接种量对芽孢形成的影响接种量是与培养基利用率直接相关的参数。
接种量大时尽管可以使芽孢生长快、周期短，但后期可能因缺乏营养而无法达到较高的芽孢数；而接种量太小时不仅对营养利用不充分，且发酵周期可能延长，染菌几率提高［10］。
在确定最佳培养基组成成分后，将其接种量设为4%，5%，6%，7%和8%5个因素水平进行试验，结果见图1。
