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苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。
经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。
关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器设备和试剂超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。
超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。
1.1.2 研究菌株本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。
1.1.3 供试昆虫菜青虫。
1.1.3 培养基种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。
121℃灭菌30 min。
蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。
发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。
调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。
1.2 方法1.2.1 种子液的培养在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。
1.2.2 菌株发酵按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。
1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4]氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶液中带正电荷、在碱性溶液中则带负电荷。
若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。
因为净电荷为零，净电斥力不存在，大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种常见的土壤细菌，被广泛用作生物杀虫剂。
它通过产生特殊的杀虫晶体蛋白（Cry蛋白），对某些昆虫的幼虫具有高度的杀虫活性，对环境和人类安全无害。
本文主要探究苏云金芽孢杆菌的筛选方法，并研究其对蚊科幼虫的杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌的筛选可以通过以下步骤进行：采集土壤样品，将其接种到富含营养的培养基中，如T3培养基。
将培养基孵育在适宜的温度下，并进行连续传代培养，以保持苏云金芽孢杆菌的纯度和活力。
接下来，用半定量法检测培养基中的苏云金芽孢杆菌数量。
可以使用琼脂糖平板法，将一定体积的培养基平铺在琼脂糖平板上，然后在适宜温度下培养。
苏云金芽孢杆菌形成的典型菌落呈灰白色，巨大菌落的培养液显示菌落明显，以及青霉菌类在菌落表面的出现等都是筛选的重要指标。
然后，根据苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性，进行活性筛选。
将苏云金芽孢杆菌转接到含有蚊科幼虫的培养基中，进行培养。
观察苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫效果，并进行杀虫活性测试。
可以通过观察幼虫的死亡情况、体表异常和生长抑制等指标来评估杀虫活性。
选取具有较高杀虫活性的苏云金芽孢杆菌进行进一步研究。
可以通过形态学观察、鉴定晶体蛋白类型和测定晶体蛋白的产量等方法，对选择出的苏云金芽孢杆菌进行深入研究。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性主要依赖于其产生的Cry蛋白。
Cry蛋白在蚊科幼虫的肠道内起到杀虫作用。
当幼虫摄入含有Cry蛋白的培养基时，Cry蛋白与幼虫肠道内的特定受体结合，使幼虫肠道发生溶解和结构破坏，最终导致幼虫死亡。
Cry蛋白具有高度的选择性，对昆虫的杀伤作用明显，而对其他生物几乎无毒性。
研究表明，苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫具有较高的杀虫活性。
对白纹伊蚊幼虫的研究发现，苏云金芽孢杆菌具有很好的杀虫效果。
实验结果显示，苏云金芽孢杆菌处理组的幼虫死亡率明显高于对照组，而且处理组的幼虫体长、体重显著低于对照组，说明苏云金芽孢杆菌不仅能有效杀死蚊科幼虫，还能抑制其生长发育。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，简称Bti）是一种广泛应用于生物农药领域的细菌，被广泛应用于蚊虫控制。
本文主要介绍苏云金芽孢杆菌的筛选方法及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌主要通过筛选分离或遗传改造获得。
筛选分离方法主要包括土壤样品采集、产孢核查、杀虫活性测定等步骤。
采集土壤样品，可以从湖泊、河流、池塘、沼泽等水源附近的土壤中采集，因为这些地方通常是蚊子孳生的地方。
然后，将土壤样品接种在含有适宜营养物质的培养基中，促使苏云金芽孢杆菌的生长。
接下来，通过形态学观察和生物学特性鉴定来确认是否获得了苏云金芽孢杆菌。
使用家蚊幼虫等蚊科昆虫幼虫进行杀虫活性测定，以评价苏云金芽孢杆菌的杀虫效果。
苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要通过其产生的杀虫晶体蛋白（Cry蛋白）实现。
这些Cry蛋白可以与蚊科幼虫的消化酶相互作用，破坏其肠道细胞膜，引起幼虫发生中毒死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫作用主要表现在以下几个方面：1. 快速杀虫：苏云金芽孢杆菌能迅速产生大量的Cry蛋白，只需几小时就可以导致蚊科幼虫死亡。
2. 高度选择性：苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白对蚊科幼虫具有强烈的杀虫活性，但对其他昆虫和动物没有明显杀伤作用。
3. 持久的杀虫效果：苏云金芽孢杆菌在水中具有较长的存活期，可以持续释放Cry蛋白，从而更好地控制蚊科幼虫的数量。
4. 不易产生抗药性：由于苏云金芽孢杆菌的杀虫机制是通过破坏肠道细胞膜导致幼虫死亡，而不是通过直接杀死昆虫的神经系统，因此不易产生抗药性。
苏云金芽孢杆菌是一种有效且安全的生物农药，可用于控制蚊科幼虫的数量。
它具有快速杀虫、高度选择性、持久的杀虫效果和不易产生抗药性等优点，对蚊虫的控制起到了积极的作用。
在蚊虫防控中，苏云金芽孢杆菌的应用前景广阔，但也需要在实际应用中不断完善其筛选方法和杀虫活性评估体系，提高其在蚊虫控制中的应用效果。
JIUJIANG UNIVERSITY实验论文题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。
它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。
Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。
因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。
本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。
镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。
1 材料与方法1.1 菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。
1.2 培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。
发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质 1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。
海南热带原始雨林区苏云金芽孢杆菌收鉴及cry基因的鉴定的开题报告一、选题背景和意义海南岛位于中国最南端，被誉为中国的热带天堂，是全国唯一的热带岛屿。
海南热带原始雨林区是中国热带雨林最大、完整、保存最好的自然保护区之一，也是中国珍稀植物、野生动物、微生物资源的重要产地。
其中，苏云金芽孢杆菌是一种产生β-内酰胺酶的细菌，在医疗领域具有重要的应用价值，如治疗肺炎、腹腔感染等疾病。
目前，苏云金芽孢杆菌的研究尚处于初级阶段，对于该菌株的分离和鉴定还需要进一步的研究深入，特别是在海南热带原始雨林区的资源开发和利用中，苏云金芽孢杆菌具有非常重要的意义。
因此，本文将对海南热带原始雨林区苏云金芽孢杆菌的收鉴及cry基因进行鉴定研究，为该菌株的进一步利用提供科学依据和技术支持。
二、研究方法本研究将采用以下方法：1.样品采集：在海南热带原始雨林区进行样品采集，包括植物和土壤等样品。
2.苏云金芽孢杆菌分离和鉴定：在实验室中进行苏云金芽孢杆菌的培养和分离，通过形态学、生理生化鉴定等方法进行初步鉴定，并利用分子生物学方法对其进行更为准确的鉴定。
3.cry基因的鉴定：利用PCR扩增、Southern blot检测等分子生物学技术对苏云金芽孢杆菌的cry基因进行鉴定，并进行序列分析。
4.研究结果分析：对苏云金芽孢杆菌的分离鉴定和cry基因的鉴定结果进行分析和解读，探讨其在医学、农业等领域的应用价值。
三、预期研究结果1.成功分离并鉴定出苏云金芽孢杆菌。
2.成功鉴定cry基因序列，并对其进行分析和解读。
3.对苏云金芽孢杆菌的应用价值进行探讨与分析。
四、研究意义1.本研究可以为海南热带原始雨林区的微生物资源开发和利用提供参考和依据。
2.可为苏云金芽孢杆菌的利用提供重要的科学依据和技术支持。
3.有助于促进海南地区的科学研究和资源利用。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，简称Bti）是一种广泛应用于生物防治的杀虫菌株，特别适用于蚊科成虫和幼虫的控制。
本文将介绍苏云金芽孢杆菌的筛选方法以及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌的筛选通常是通过多步骤的实验流程进行的。
首先，需要收集环境中具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，可以是土壤、水体和其他环境样品。
然后，将这些样品分别进行细菌培养，通过高温杀菌等方法选择出富含苏云金芽孢杆菌的培养物。
接下来，将这些培养物进行纯化和鉴定，选择纯度高且效果好的苏云金芽孢杆菌菌株。
对于蚊科幼虫的杀虫活性测试，常采用生物学和生化学方法。
生物学方法包括黏贴法、培养沉降法、萤光健康法等。
这些方法通过将苏云金芽孢杆菌菌株与幼虫接触，观察幼虫的死亡情况以及菌株对幼虫的毒力大小。
生化学方法则是通过分析苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的毒杀机制，了解其杀虫活性的作用途径和影响因素。
研究表明，苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫具有较高的杀虫活性。
其主要作用机制是通过产生一种称为晶体蛋白（Cry）的毒素来杀死幼虫。
这种毒素进入幼虫消化系统后，被分泌的蛋白酶降解，释放出毒素结晶体，然后结晶体溶解并结合到幼虫肠道上皮细胞的受体上，导致细胞破裂和死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性受多种因素的影响，如菌株的纯度、菌液的浓度、幼虫的种类、菌株与幼虫的接触时间等。
一般来说，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性较高，对蚊科幼虫的毒力大，可以达到较好的防治效果。
总体而言，苏云金芽孢杆菌的筛选方法较为简单，其对蚊科幼虫的杀虫活性较高。
将苏云金芽孢杆菌应用于蚊虫的综合防控中，有助于减少农药的使用，保护生态环境，提高防控效果。
※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。
发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。
通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。
该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。
关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis）是一种常见的杀虫菌，广泛应用于农业和公共卫生领域。
它的杀虫活性主要来自于其产生的毒素，可以有效地杀死蚊科昆虫的幼虫。
苏云金芽孢杆菌的筛选主要是通过对分离自环境样品中的菌株进行鉴定和评估。
常见的分离来源包括土壤、水体、植物等。
一般来说，筛选菌株的第一步是通过形态学特征和生理生化特性的初步鉴定。
接下来，可以通过分子生物学方法（如16S rRNA基因测序）对菌株进行更准确的鉴定。
还可以对菌株的产毒性和毒力进行评估，以确定其是否适合用作杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性主要是通过其产生的晶体毒素来实现的。
这些毒素可以刺激蚊科幼虫肠道上皮细胞的破裂和溶解，导致幼虫死亡。
苏云金芽孢杆菌还可以通过释放其他毒素和代谢产物来对蚊科幼虫产生杀虫效果。
这些毒素和代谢产物可以作用于幼虫的神经系统和消化系统，干扰其正常的生理功能，最终导致幼虫的死亡。
对于苏云金芽孢杆菌的杀虫活性研究，常见的方法是测定其对蚊科幼虫的致死浓度（LC50）和致死时间（LT50）。
一般来说，测定LC50和LT50的实验可以采用不同的方法，如浸泡法、喷雾法和临界测定法等。
这些实验可以帮助确定苏云金芽孢杆菌的杀虫效果，并且可以与其他杀虫剂进行比较。
还可以通过评估蚊科幼虫的生长和发育情况、观察幼虫的行为和表现等，来进一步了解苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的影响。
苏云金芽孢杆菌是一种有效的杀虫剂，对蚊科幼虫具有较高的杀虫活性。
通过对其进行筛选和评估，可以选出具有较高杀虫效果的菌株，并进一步研究其作用机制和应用潜力。
这对于控制蚊类传播的疾病和减少蚊虫对人类健康的威胁具有重要意义。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，被广泛应用于农业、环境和医疗等领域。
本文旨在探讨苏云金芽孢杆菌的筛选方法以及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
一、苏云金芽孢杆菌的筛选方法苏云金芽孢杆菌的筛选主要通过以下几个步骤进行：1. 采集土壤样品：苏云金芽孢杆菌广泛存在于土壤中，因此采集土壤样品是筛选的第一步。
可以选择具有丰富苏云金芽孢杆菌资源的农田、森林等地。
2. 分离纯菌株：将采集到的土壤样品进行稀释和均匀分布于培养基表面，利用拭子或铂丝在相应条件下培养，形成单菌落。
通过进行传代分离，最终得到纯菌株。
3. 筛选菌株：采用一系列不同的培养基和条件，如温度、pH值、营养物质组成等，筛选出具有较高活性和杀虫特性的苏云金芽孢杆菌菌株。
4. 评价活性：利用一定的方法和指标来评价苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性。
常用的方法包括计数存活率、计算致死浓度等。
二、苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫具有一定的杀虫活性，主要通过其产生的抗菌物质和代谢产物实现。
1. 抗菌物质：苏云金芽孢杆菌在生长过程中，会产生一类称为杀菌肽的抗菌物质。
这些抗菌物质具有广谱抗菌活性，可以对蚊科幼虫的生长和发育产生抑制作用。
2. 代谢产物：苏云金芽孢杆菌在生长过程中，还会产生一系列的有机酸、酶和其他代谢产物。
这些代谢产物可以对蚊科幼虫的生理和代谢过程产生干扰，从而导致其死亡。
3. 其他作用机制：苏云金芽孢杆菌还可以通过与蚊科幼虫共生的方式来抑制其生长。
菌株会在蚊科幼虫体内生长繁殖，释放出一些有害物质，导致蚊科幼虫死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性受到多种因素的影响，如菌株的鉴定和筛选结果、培养条件和培养基组成等。
在具体应用中，需要进行进一步的研究和优化，以提高苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫效果。
苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定09级园林工程系生物技术及应用班级(制作人—王珏指导教师—韩磊)内容提要本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。
关键词苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法1.1实验材料1.1.1玻璃器皿烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等1.1.2实验仪器超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等1.1.3其他用具研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等1.1.4实验材料土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉1.2方法与步骤1.2.1选择性培养及扩大培养1.2.1.1灭菌前准备1)PBA培养基的制备PBA培养基配方（1L）配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。
注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠）2）灭菌器材的准备将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
1.2.1.2灭菌1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水；2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟；3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的过程；4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到0mpa时打开放气阀放气。
放完气后关掉放气阀接通电源，再次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接通电源；此后为升压保压的过程；5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。
重复上一步操作，使此过程保持20分钟。
此后为降压出锅过程；6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出；1.2.1.3样品的预处理三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置1.2.1.4超净工作台的准备接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。
1.2.1.5无菌操作1）培养基的完善及分装（对照试验）分装到无菌的小三角瓶内。
注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。
）2）接种各组将适量的样液过滤液过滤到搖瓶培养基内，然后在搖瓶外壁上标明样品名称、接种时间及小组序号；最后将所有的搖瓶包扎好进行培养。
1.2.1.6培养在所有搖瓶的外壁上标明样品名称、接种时间及小组号，随后将搖瓶置于200r、min的摇床上进行培养。
培养24h后下摇床并置于冰箱内保存，等待菌种分离1.2.2菌种分离及纯化1.2.2.1灭菌前准备1)BP培养基的制备BP培养基配方（1L）配方牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂PH用量5g 10g 5g 20g 7.0-7.2配置900mL的BP固体培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。
注（制备的培养基中有600mL不含氯化钠）2）灭菌器材的准备将需要灭菌的培养皿、涂布棒、移液管、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
1.2.2.2灭菌准备就绪后利用手提式灭菌锅进行灭菌（121℃,20min）。
1.2.2.3超净工作台的准备接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。
1.2.2.4无菌操作1）培养基的完善及分装（对照试验）倾注到无菌的培养皿内。
注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。
）2）涂布接种平板培养基的凝固→用无菌的移液管从搖瓶内吸取1-2mL的菌液→涂布平板1.2.2.5培养在所有平板的外壁上标明样品名称、接种时间及小组号，随后将搖瓶置于30℃的光照培养基内进行培养，三天后观察并记录结果。
1.2.2.6菌种的分离及纯化观察菌种在不同平板培养基中的长势并对其进行分析，然后挑选出长势较好的平板菌种进行纯化，对个别菌种进行分离。
1）BP固体培养基的制备制备400mL的BP固体培养基→分装出十三只试管（每管大约10mL培养基，用于菌种分离）→将所剩的培养基装于三角瓶内→分别对试管、三角瓶封口并包扎→灭菌（121℃,20min）2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿接种环进行分别包扎后用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
3）无菌操作（即：菌种的分离及纯化）超净工作台准备就绪后事先将灭菌的培养基倒平板，然后在酒精灯火焰附近将长势较好的平板菌种进行纯化；纯化后再将挑选出的个别单菌落进行分离。
4）培养将纯化的平板菌种和分离出的试管菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养。
1.2.3菌种的鉴定由于第一次进行分离时菌种长势不好所以利用的是补救实验中再次分离出的四种不同的菌种以及从菌粉中分离出的六个菌种进行了鉴定。
1.2.3.1菌种的分离1）BP固体培养基的制备制备500mL的BP固体培养基后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。
2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。
3）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
4）菌种的分离超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近将挑选出的四种平板菌种分离到试管斜面上。
5）培养标记好分离菌种的形态及代号后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果。
另外从购买的苏云金芽孢杆菌纯菌粉中分离出菌种1）BP固体培养基的制备制备500mL的BP固体培养基后事先分装出200mL试管培养基；随后将剩余的培养基置于大三角瓶内，随后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管和三角瓶进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。
2）无菌水的制备分别向五个小三角瓶内加放10mL、9mL、9 mL 、9 mL 、9 mL 的蒸馏水；随后用棉塞和牛皮纸进行包扎，以备灭菌（121℃,20min）。
3）其他灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环、涂布棒进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。
4）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
5）菌种的分离超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近进行无菌操作。
操作流程如下：倒平板→平板培养基的凝固→菌悬液的制备（称取0.0001g菌粉溶于10mL的无菌水中）→摇匀→菌悬液的梯度稀释（利用其他四瓶无菌水完成负一至负四梯度的稀释，）→摇匀稀释液→徒步接种（每梯度的稀释液重复两个平板）→培养→适时转接试管斜面→培养注（每次在用移液管和涂布棒的前后务在酒精灯火焰处进行灭菌，且在其温度降下后再使用为的是其避免烫死菌体）1.2.3.2菌种的鉴定一、明胶液化实验1)实验原理：有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶（即：类蛋白水解酶）。
明胶酶能将明胶水解为多肽，进一步水解为氨基酸，使得明胶失去凝胶性质而液化。
又明胶在20℃的温度下开始液化且培养温度却高于20℃，所以让培养后的平板和试管菌种经过低温处理或者利用倾注酸性升汞法来验证该菌是否产生明胶酶即：是否为阳性，从而排除温度对明胶液化的因素。
2）操作步骤：明胶培养基配方（1L）按照培养基配方配置1400固体培养基↓分装试管（800mL）（每支斜面培养基高度约为试管的1/2）↓灭菌器才的封口及包扎↓灭菌（121℃,20min）↓超净工作台的准备及表面消毒↓平板培养基的分装及冷凝↓穿刺接种及点植（对4-10号菌种进行穿刺及点植）↓标记↓培养（将平板、试管菌种置于36℃的光照培养箱昂内进行培养，三天后观察结果）3）鉴定过程挑选出每种菌体经点植后长势较好的平板菌种→40ml酸性升汞的配置→滴加升汞→静置→与没有滴加升汞的菌种进行对比，观察现象。
滴加升汞的过程对照试验：成分明胶琼脂蒸馏水用量4g 5g 1000mL按照上述配方配置500mL的培养基↓倒平板↓培养基的凝固↓滴加升汞↓静置↓与空白最对照，观察现象二、精氨酸脱羧酶试验1）实验原理：有的菌体能产生脱羧酶，令氨基酸发生脱羧反应生成胺和二氧化碳，从而使得培养基的PH发生变化。
利用该原理使分离出的菌落在加放精氨酸的培养基上进行生长，让溴甲酚紫作指示剂，来验证菌体的特性。
补充：溴甲酚紫显色原理其变色范围为pH（5.2-6.8）；当pH为5.2时显黄色，当pH为6.8时显紫红色。
2）方法与步骤（1）培养基的制备精氨酸培养基配方制备500mL的精氨酸液体培养基（不含DL-精氨酸）后分装至31个试管内，随后往21个试管内滴加适量的石蜡封口；最后用牛皮纸和麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。
注（因DL-精氨酸不能高温加热，所以在培养基灭菌之后再向各个管中滴加DL-精氨酸；）（2）灭菌器才的准备将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种针、镊子、棉花以及盛有20mL蒸馏水的三角瓶进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。
（3）灭菌准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。
（4）培养基的完善称取0.5g精氨酸→溶于无菌水中→摇匀→置于无菌的培养皿内→无菌针头内无菌棉的加放→药品的吸取→加放精氨酸（每支管加放0.4mL）→摇匀培养基→接种（每个菌种取三次样分别置于两个滴加精氨酸的培养内和一个不加精氨酸的培养基内）→摇匀→标记→培养→观察管内变化注（在使用接种针的前后都要对其进行灼烧即：灭菌，且灭菌之后必须将其降温再使用，避免烫死菌落）对照试验接种之前事先留出一只不加精氨酸和一只加放精氨酸的培养基，随后不加放菌落随同接种的菌管进行培养。
（5）培养标记好分离菌种的代码后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果并得出结论。
保种为了以后生化实验对菌种的供应，所以对各个菌种进行保存；转接前剔去不知菌种来源以及不能再使用的试管菌种。
