western错误大观

成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．看看各部分出问题的几率，为还没有成功，仍然苦苦寻找结果的战友提供点参考（由于本人经验有限，不足之处还请斑竹和各位大侠改正）：1、蛋白提取问题，蛋白降解，或者上样量少导致检测失败。

2、蛋白电泳失败。

3、转膜问题：转膜不充分，过转，温度过高导致蛋白结构改变等。

4、抗体问题。

5、显影问题。

6、其它。

请战友提供各部分问题的主要说明和对策，谢谢！祝蛋白版越来越旺！大家来讨论，加分从优！抗体问题排在第一，抗体的特异性，一抗二抗的比例，这些都需要摸索条件。

蛋白电泳第二，胶的配置，由于APS的失效，tris-Hcl PH不准，丙烯酰胺的氧化（以上问题一般都是配置时间较久以后）导致电泳失败或泳道奇形怪状。

我认为western bloting 中蛋白提取是关键，最好用试剂盒提取，尤其目的蛋白是在亚细胞器表达的蛋白；其次是一抗二抗，一抗最好单克隆抗体，二抗国产好厂家的也行；ECL 发光试剂一定要灵敏；制胶，电泳和转膜个实验室都做得比较常规了；显影定影按说明书作做活实验是经验就行。

jiangyuqing123 wrote:大家来讨论，加分从优！偶不懂,特来支持,我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer 裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。

有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。

这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。

因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

western blot失败经验总结1我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。

有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1 ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。

这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。

western blot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧ心得１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/m l) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。

⾎泪教训，Westernblot最全避雷⼿册。

谨以此⽂，纪念那些年我做过的Western blot。

—— ⼀位不愿透露姓名的科研民⼯提起Western blot (WB)，很多⼈都能哭诉半宿。

这是⼀个基础实验，也是⼀个让⼤家头疼的实验，简称“⽞学”。

话不多说，做过的都懂。

今天给⼤家提供WB最全避雷⼿册，希望⼤家能愉快实验，顺顺利利。

This is the dividing line.倾尽全⼒，长⽂预警1、WB有什么优点？答：灵敏，可达ng级，⽤ECL显⾊法可达pg级。

灵敏，相对便宜且特异性⾼。

2、为什么我的细胞提取液中没有⽬标蛋⽩？答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋⽩质，换⼀种细胞或查⽂献弄清楚；b)你的细胞中的蛋⽩质被降解掉了，你必需加⼊PMSF，抑制蛋⽩酶活性；c) 你的抗体不能识别⽬的蛋⽩，检查抗体说明书，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a)有沉淀可能因为你的蛋⽩没有变性完全，可以适当提⾼SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，⼀般需96℃以上10-15min左右；b) 也不排除你的抗原浓度过⾼，这时需再加⼊适量上样缓冲液。

4、我做的蛋⽩质分⼦量很⼩(10KD左右)，请问怎么做WB？答：尽量选择0.2µm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在⼀起再电转。

5、我的⽬的带很弱，怎么加强？答：最主要是加⼤抗原上样量；同时也可以将⼀抗稀释⽐例上调。

6、胶⽚背景很脏，有什么解决⽅法？答：减少抗原上样量，降低⼀抗浓度，改变⼀抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件⽐37℃1h要温和很多)，并提⾼封闭液浓度。

7、⽬标带是空⽩，周围有背景，是为什么？答：你的⼀抗浓度较⾼，⼆抗上HRP催化活⼒太强，同时你的显⾊底物处于⼀个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空⽩即“反亮现象”。

将⼀抗和⼆抗浓度降低，或更换新进⼝的显⾊底物。

8、我的胶⽚是⼀⽚空⽩，是怎么回事？答：如果能够排除下⾯的⼏个问题那么问题多半出现在⼀抗和抗原制备上。

Western blotting 常见问题分析SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析Western Blotting实验流程第一步：蛋白样品制备蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。

RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。

第二步：蛋白定量为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。

蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。

如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。

第三步：电泳(1) SDS-PAGE凝胶配制沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）；PMSF(100mM)（WB0016）；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。

(2) 样品处理每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。

置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。

(3) 上样与电泳第四步：转膜转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。

关于western blot原理和常见故障分析关于western blot原理:通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体作为探针,对靶物质进行检测,蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1~5ng(最低可到10-100pg中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备A:样品的制备1组织:组织的处理方法:组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS,0℃研磨,加入5×STOP buffer,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins离心,取上清。

加入β-ME(9.5ml加入0.5ml,溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

2细胞:细胞的处理方法:离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer,收集,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins离心,取上清。

加入β-ME(9.5ml 加入0.5ml,溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

3分泌蛋白的提取(特例:直接收集分泌液,加入β-ME、溴酚蓝制样。

B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法:双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。

在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法。

硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。

双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。

双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定。

干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如Tris、Good缓冲液等。

可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。