westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。

Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。

它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。

本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。

一、原理。

Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。

首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。

接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。

最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。

二、步骤。

1. 样品制备。

将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。

然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。

2. 凝胶电泳。

将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。

根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。

3. 转膜。

将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。

4. 封闭。

将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。

5. 抗体孵育。

将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。

6. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育。

将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。

8. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。

9. 检测。

通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。

总结。

Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。

掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。

westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。

它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。

二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。

-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。

-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。

2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。

-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。

-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。

3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。

-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。

-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。

-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。

三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。

-完全溶解样品，可加热至95°C处理。

2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。

-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。

-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。

3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。

-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。

免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

)储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。

该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。

以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。

首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。

二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。

2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。

3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。

4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。

5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。

6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。

以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。

westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。

与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。

同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。

每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。

不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。

Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。

1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。

加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。

移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。

上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。

【具体方法】2.电泳（Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。

当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。

通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。

这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。

2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。

蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。

SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。

电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。

封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。

抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。

蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。

WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。

本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。

一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。

其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。

常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。

然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。

3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。

然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。

4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。

通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。

5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。

最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。

二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。

2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。

3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。

4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。

5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。

背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。

Neal Burnette 于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。

最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。

一、蛋白质的样品制备：由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。

蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:> 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

> 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。

尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。

> 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。

> 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

> 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。

除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。

二、蛋白质定量如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。

具体方法见各试剂盒说明书。

为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。

WesternBlot原理和操作方法样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样本中提取目标蛋白质。

常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯化等。

提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋白质。

接下来，需要将样品进行电泳分离。

这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。

SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。

电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的带状条带。

接下来是转膜的步骤。

将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。

这通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。

电场将带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。

然后进行免疫反应。

转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。

一般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。

然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。

抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。

最后是图像开发阶段。

Western Blot的图像开发通常是通过酶标记二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。

这意味着在膜上的蛋白质上有特异性抗体结合。

然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，以获得目标蛋白质的图像。

总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用于分析复杂的蛋白质混合物。

它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和分离出特定的蛋白质。

虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。