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血凝和血凝抑制试验作者：陈美艳罗福斌任芬来源：《云南农业》 2020年第9期陈美艳1，罗福斌1，任芬2（1.新平县动物疫病预防控制中心，云南新平 653400；2.新平县畜牧站，云南新平653400）摘要：血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术。
试验通过首先制备红细胞沉降良好的分数为1%鸡红细胞悬液；其次抗原血凝效价准确；第三4HAU工作抗原配制；第四血凝抑制滴定读数准确。
关键词：4HAU抗原；血凝；血凝抑制血凝、血凝抑制试验是目前兽医实验室用于禽疫苗免疫抗体水平监测技术，也可用已知标准阳性血清（抗体）监测是否有该病毒（抗原）的存在。
实验室用血凝、血凝抑制试验检测鸡血清中禽流感和新城疫抗体，其血凝反应（HA）可以理解为，禽流感病毒和新城疫病毒或其血凝素能和鸡红细胞发生凝集反应致使红细胞不能自然沉降。
血凝抑制反应（HI）理解为，当禽流感和新城疫工作抗原和血清样品中抗体反应后，则红细胞就不能再与工作抗原发生反应，这时红细胞就呈现出自然沉降现象，当血清样品抗体不足以和工作抗原反应时，工作抗原就和红细胞发生凝集反应。
1 材料与方法1.1 供试材料和试剂96孔U型微量反应板、移液枪及配套滴头，禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H9亚型阳性血清、阴性血清、体积分数为1%鸡红细胞悬液、灭菌生理盐水和加样槽。
1.2 试验方法1.2.1红细胞沉降良好的体积分数为1%鸡红细胞悬液制备为避免出现红细胞自凝现象，一般选用至少3只健康公鸡分别采血，并清洗红细胞后配制成体积分数为10%红细胞悬液，最后配制成体积分数为1%红细胞悬液。
若1%鸡红细胞悬液用量大于100 mL时也可直接配制。
一般按照等比例混匀体积分数为1%鸡红细胞悬液，如在试验过程中遇到特殊情况，无法满足等量比例混合时也可适当调整比例。
整个试验过程只能使用同1份鸡红细胞悬液，并保持混匀以确保红细胞均匀；如有红细胞破裂或者被污染情况，试验无效。
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
血凝抑制试验原理
血凝抑制试验是一种检测抗凝血功能的实验方法。
其原理是通过观察某种物质对血液凝固过程的影响，来判断该物质的抗凝血效果。
在血凝抑制试验中，首先从受试者的静脉或指尖采集一定量的新鲜全血。
然后将血液放入一种试验管中，加入适量的抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠。
接下来，加入激动剂，如胶原或凝集素，以促使血液开始凝固。
同时，加入需要测试的抗凝物质。
血液开始凝固时，血小板会聚集并黏附在血管内壁上，最终形成血凝块。
然而，如果所加入的抗凝物质具有抗血凝的效果，它会阻止血小板的聚集和凝血因子的活化，从而抑制了血凝块的形成。
观察试管内的血液变化，若血液凝聚程度较低或完全没有凝结，则说明所测试的物质具有良好的抗凝效果。
相反，如果血液凝聚程度较高，则说明该物质对血凝过程没有明显的抑制作用。
血凝抑制试验广泛应用于临床诊断和药物研发领域。
通过检测不同物质对血液凝固的影响，可以评估患者的凝血功能，判断其是否存在凝血系统的异常。
同时，该试验也为开发新型抗凝药物和评估其抗凝效果提供了重要的参考依据。
一、实验目的1. 理解血凝现象的原理。
2. 掌握血凝实验的操作步骤。
3. 学习通过血凝实验判断血凝素和血凝抑制抗体的存在。
二、实验原理血凝现象是指某些病毒能够凝集动物红细胞的能力。
利用这一特性，可以通过血凝实验检测病毒的存在以及血清中抗体的水平。
血凝抑制试验（HI试验）是一种常用的血清学检测方法，通过检测血清中的血凝抑制抗体，可以判断感染状态、疫苗接种效果等。
三、实验材料1. 红细胞：鸡红细胞、兔红细胞等。
2. 病毒：流感病毒、副流感病毒等。
3. 血凝素（HA）：用于血凝实验。
4. 血凝抑制抗体（HI）：用于血凝抑制实验。
5. 实验器材：微量移液器、酶标板、振荡器、离心机等。
四、实验方法1. 血凝实验（1）将红细胞用生理盐水洗涤三次，制成1%的红细胞悬液。
（2）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（3）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝现象的孔数。
2. 血凝抑制实验（1）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（2）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（3）在第三至第六排孔中加入不同浓度的血清。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝抑制现象的孔数。
五、实验结果与分析1. 血凝实验通过观察实验结果，发现病毒悬液孔数越多，红细胞凝集现象越明显。
说明病毒具有血凝活性。
2. 血凝抑制实验通过观察实验结果，发现不同浓度的血清孔数出现血凝抑制现象的孔数不同。
说明血清中含有能够抑制血凝的抗体。
六、实验结论1. 血凝实验结果表明，病毒具有血凝活性。
血凝抑制实验报告10篇血凝抑制实验报告11 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。
2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL 阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min 离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。
（此步可省略，直接配制1%红细胞）2.4 1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。
（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清）3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理盐水），换滴头。
3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混匀。
3.3从第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25μl 弃之，换滴头。
