茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定

植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。

然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

二、仪器及试剂1. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；2 .试剂及配制：冰醋酸；甲苯。

2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L －1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床摇动溶解，贮于4℃冰箱中。

3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制三、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1 取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min （注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），取出冷却，各试管再加入2ml 甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

1.2 以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

1.3 标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的测定2.1 脯氨酸的提取液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管, 然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。

（注意：样品一定要精确称量并记录）离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。

2.2 测定加入1ml冰醋酸及1ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。

冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

实验20 植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。

植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。

用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。

此法有专一性。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物叶片。

（二）试剂• 80%乙醇。

• 人造沸石。

• 活性炭。

4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃）溶解。

试剂至少在 24 小时内稳定。

5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ，其浓度为100 μg/mL 。

再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成10 μg/mL 的脯氨酸标准液。

（三）仪器设备分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒温水浴三、实验步骤1 ．绘制标准曲线吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、20.0 μg 。

分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。

用分光光度计于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。

将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。

2. 植株样品液的提取选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。

目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。

本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。

一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。

该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。

因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。

除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。

（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。

2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。

3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。

现用现配。

（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。

（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。

（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。

（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。

脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。

与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。

羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。

在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。

Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、滤纸或纱布5、水浴锅6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TO111350TStorage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。

茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。

因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。

一、【目的】在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。

二、【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。

脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。

（有的用80%酒三、【仪器与用具】分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5〜10ml注射器或滴管。

2.5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml2mol/L磷酸（以3:2混合），在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4°C下2〜3d有效。

3.脯氨酸标准溶液:准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100p g/ml。

再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10p g/ml的脯氨酸标准液。

再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0p g/mL 的系列溶液。

四、【方法与步骤】样品脯氨酸提取：取不同处理（干旱处理与对照）的剪碎混匀小麦叶片各0.3g（干样根据水分含量酌减），分别置于20ml具塞试管中，加入5ml3%硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。

取出试管，待冷却至室温后，过滤，滤液待测。

显色取9支具塞刻度试管，编号。

植物体内游离脯氨酸含量的测定一,原理当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加.植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况,因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标.用人造沸石在pH 1~7 范围内振荡溶液,可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应(如甘氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,丙氨酸,缬氨酸,胱氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等),脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应,其含量与颜色深浅成正相关,可用分光光度计测定.此法有专一性.二,实验材料,试剂与仪器设备(一)实验材料植物叶片.（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。

（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。

三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

植物体内游离脯氨酸的测定在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低。

但在逆境（如旱、寒、盐等）条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可增加10-100倍，因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性指标。

植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。

在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物（结构如下），用比色法于520um波长下测定脯氨酸的含量。

仪器设备：分光光度计、析天平、恒温水浴、研钵、容量瓶、具塞试管：25毫升9支、移液管：2毫升4支、5毫升2支、漏斗、滤纸。

1．称取0.5000g剪碎烟叶加入试管，加5ml 3%磺基水杨酸，封口，沸水浴10min；过滤后备用。

2．吸取2ml提取液加入试管（对照管用2ml水代替），各加入2ml冰醋酸，4ml 茚三酮，摇匀，煮沸30min，冷却比色（OD520）试剂配制：1．3%磺基水杨酸：称3.000g磺基水杨酸溶解，定容至100ml。

2．茚三酮：称2.50g茚三酮，加60ml冰醋酸和40ml 6M磷酸，在热水（70°C）溶解，一般现用现配（24小时）6M磷酸：吸取86ml磷酸，定容至250ml.试剂酸性茚三酮：称取2.5克弗三酮，加入60毫升冰醋酸和40毫升6M磷酸（冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制），于70℃下加热溶解。

冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。

4℃下2～3日内有效。

脯氨酸标准溶液：称取0.0250克脯氨酸，溶解在250毫升蒸馏水中，其浓度为100微克／毫升。

再取此液10毫升，用蒸馏水稀释至100毫升，即为10微克／毫升之脯氨酸标准液。

冰醋酸甲苯若用磺基水杨酸提取，需要配制3%的磺基水扬酸溶液。

（若用酒精提取，需要80%的酒精，活性炭，人造沸石）。

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。

植物体内游离脯氨酸含量的测定二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。

然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

三、材料、仪器及试剂1. 材料：植物叶片。

2 .试剂及配制：2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。

3％磺基水杨酸配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。

冰醋酸；甲苯。

四、实验步骤1.脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。

取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡1.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

1.3标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g，液氮处理保存，材料放入研钵中并加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液研磨匀浆，然后转入10mL离心管中，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后于3000 rpm离心10min，上清转入5mL离心管中，上清即为脯氨酸的提取液（于4℃中保存）。