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固相萃取-高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘范素芳;马俊美;俞婧;王娟;刘红冉;李强;张岩【摘要】本实验建立了基于固相萃取的高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘含量.样品用正己烷溶解,经Cleanert BAP-3固相萃取小柱净化,采用C18色谱柱分离,以乙腈/水=80/20(V/V)为流动相,经荧光检测器检测.结果表明苯并(a)芘在0.50 μg /L ~ 50 μg /L浓度范围内线性良好,相关系数为0.9999,方法检出限为0.1 μg /kg,样品加标回收率为89.00% ~ 94.46%,RSD为1.0% ~ 2.2%.该方法具有快速、准确、灵敏、简单等特点,可用于植物油中苯并芘的检测.【期刊名称】《河北省科学院学报》【年(卷),期】2017(034)002【总页数】5页(P47-51)【关键词】固相萃取;高效液相色谱法;植物油;苯并(a)芘【作者】范素芳;马俊美;俞婧;王娟;刘红冉;李强;张岩【作者单位】河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004;河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室,河北石家庄 050004【正文语种】中文【中图分类】O657苯并(a)芘又称3,4-苯并芘，是由苯环和芘分子结合而成的多环芳烃类化合物[1]，具有高度脂溶性[2]，并且性质稳定, 不易降解，是常见的高活性间接致癌物的一种，苯并(a)芘具有致畸、致突变作用[3]。
植物油是人类食用频率最高的食物之一，在油料作物的种植、加工、运输和烹调的过程中，容易污染苯并(a)芘 [4-5]，虽然含量通常较低，但其毒性较大，对油脂的营养品质和人体健康都造成的不容忽视损害。
植物油脂中苯并（a ）芘的测定-高效液相色谱法本方法参考国标方法：动植物油脂苯并（a ）芘的测定反相高效液相色谱法，GBT 22509-2008；该国标源自ISO 15302:2007，MOD 方法。
相关技术差异为：对仪器设备作了改动；氧化铝柱采用天津博纳艾杰尔科技有限公司的商品氧化铝固相萃取柱；将洗脱溶剂改为采用重蒸后的石油醚；待测液定容体积改为300µL，采用仪器自动进样，进样量为20µL；采用外标法定量计算。
方法内容：1．适用范围本方法适用于动植物油脂中苯并（a ）芘的检测。
本方法的最低检出限为0.3-0.5µg/Kg，该最低检出限为对应所使用的仪器的检出限，因此仪器荧光检测器的灵敏度对应检出限。
2．方法原理样品经石油醚溶解，通过商品氧化铝固相萃取柱（活度为Ⅳ级，粒径大小为100-200目）吸附脂肪酸等，用石油醚洗脱苯并（a ）芘，采用反相高效液相色谱法分离，荧光检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，采用峰面积外标法定量。
3．试剂与材料3.1 色谱纯正己烷；石油醚，每升加4g 氢氧化钾重蒸；3.2 氧化铝固相萃取柱：100-200目，brockmann 活度Ⅳ级，在室温下避光保存，天津博纳艾杰尔科技有限公司；3.3 苯并（a ）芘标准储备液：称取10mg 标准品于10ml 容量瓶中，用正己烷定容，配制的标准储备液浓度为1000mg/L；3.4 标准工作液：用正己烷稀释标准储备液，稀释的浓度为10µg/L。
4．仪器和设备4.1 旋转蒸发仪，大于150ml 的圆底旋蒸瓶或鸡心瓶，勿用平底旋蒸瓶；4.2 氮吹仪；4.3 涡旋混合器；QL-866 江苏海门产；4.4 2ml色谱瓶；4.5 250µL色谱瓶玻璃内插管；4.6 高效液相色谱仪，配自动进样器，荧光检测器。
5．样品前处理5.1 样品净化称取约0.300g 的油样，用5ml 石油醚溶解涡旋混合器上充分混匀。
2020年05月液相色谱-串联质谱法快速测定食用油中的苯并(a)芘郭芳芳高宏朱成晶（江苏省理化测试中心，江苏南京210000）摘要：文章建立了食用油中的苯并(a)芘的液相色谱-串联质谱法测定方法。
食用油中的苯并(a)芘经石油醚提取后，提取液用固相萃取吸附剂净化，洗脱，浓缩定容后经液相色谱-联质谱仪检测，采用内标法定量。
研究表明：食用油中的苯并(a)芘经石油醚提取，净化后测试线性良好，其相关系数大于等于0.999，检出限为0.1μg/kg 。
该方法操作简便、快速、灵敏高，可为其他产品中的苯并(a)芘提供参考。
关键词：液相色谱-串联质谱法；大气压化学电离；苯并(a)芘目前，食用油脂中苯并(a)芘的分析方法主要有免疫学法、表面增强拉曼光谱、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法（GC-MS ）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS ）等。
由于食用油成分复杂，其中苯并(a)芘含量又较低，存在着大量的干扰物质，因此灵敏度高，抗干扰强的检测方法是必要的。
GC-MS 法由于灵敏度不高，热稳定性较差，在很多时候使用受到了限制。
高效液相色谱法定性能力不够；表面增强拉曼光谱还不够成熟，应用较少，定量分析时还不够准确；免疫学检测灵敏度不高；LC-MS/MS 法却能同时提高灵敏度和提升定性能力，目前运用LC-MS/MS 测定食用油脂中苯并(a)芘鲜有报道。
文章是针对食用油中苯并(a)芘快速检测的应用研究，可用于批量样品的高通量筛查，提高工作效率，也可用于突发食品中毒分析，这些对保护人类健康具有重要的意义。
本文建立的这种液相色谱-串联质谱法测定食用油脂中苯并(a)芘的方法，快速，简便，高效，定量准确。
1实验部分1.1仪器与试剂Agilent-1260-6430液质联用仪。
石油醚，南京化学试剂股份有限公司；乙腈，德国默克有限公司。
1.2色谱条件色谱柱：C1850×2.1mm 1.8um 柱温：40℃流动相：乙腈/水＝80/20流速：0.6ml/min 进样量：20uL 1.3标准溶液的配制苯并(a)芘标准储备溶液的制备：准确移取1mL 100μg/mL 苯并(a)芘标准品于10mL 容量瓶，用乙腈定容至刻度线，-20℃保存备用。
《出口中药材中苯并芘残留量检测方法》编制说明1 任务来源根据国家认监委以国认科函[2011]54号文件下达的2011年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知，检验检疫行业标准计划内项目《出口中药材中苯并芘残留量检测方法》由陕西出入境检验检疫局承担起草，计划编号为2011B133。
2目的及意义苯并芘（benzopyrene）又称苯并（a）芘、3,4-苯并芘，英文缩写BaP，是一种常见的多环芳烃类高活性致癌、致畸、致突变物质，对人类身体健康有极大的危害。
苯并芘主要来源于石油、煤炭、木材等的不完全燃烧，可以吸附在粉尘颗粒上，也可溶解于水中，随着大气及水系的运动在自然界中迁移，大气、水体、土壤均是苯并芘的污染载体，并能在农作物的生长过程中被吸收，并迁移至食品中，对中药材来说，环境污染产生的苯并芘会迁移到中药材中，另外，中药材本身经过高温烘干、炒制等炮制过程也会产生苯并芘，如熟地黄中苯并芘含量往往较高（检测的样品中有超过100 μg/kg的），就主要是由于炮制过程不当造成。
而目前中药材中苯并芘残留量的检测研究较少，国内尚未有相关检测标准，不利于中药材的质量安全控制。
韩国2009年颁布的标准中规定，除矿物性韩药材（中药材）外的全部韩药材中苯并芘限量为5 μg/kg，而美国、欧盟、日本、中国均未对中药材中的苯并芘限量做出明确规定，但由于有些中药材是药食两性的，所以参考食品中苯并芘的限量，中国和日本为 5 μg/kg，欧盟有1.0（仅对婴幼儿食品）、2.0、5.0、10.0 μg/kg四种限量。
国外的限量要求对我国中药材的出口提出了更高的要求，有必要制定符合国内外限量要求的检测标准，以保证我国中药材的进出口贸易顺利进行。
目前中药材中苯并芘的检测标准仅有韩国食品药品安全厅颁布的一种检测方法，但通过验证，发现该方法并不适用于有些中药材样品，而且方法采用液相色谱-荧光检测法，不能对阳性样品进行确证分析，本标准通过对韩国检测方法进行改进，增加了检测方法的样品适用范围，并增加了可用于确证的气相色谱-串联质谱检测方法。
分析检测高效液相色谱法测定煎炸油中的苯并(a)芘含量倪 涵（云南省红河州质量技术监督综合检测中心，云南红河 661100）摘 要：采用液相色谱法测定煎炸油中苯并(a)芘（BaP）的含量，优化了样品前处理方法。
样品用正己烷提取，经SPE小柱净化，荧光检测器检测。
结果表明，苯并(a)芘含量在0.5～20.0 ng·mL-1线性关系良好，相关系数R2为0.999 8，检出限为0.15 μg·kg-1，定量限为0.5 μg·kg-1，3个不同加标浓度下的平均回收率为89.1%～97.8%，相对标准偏差为0.8%～2.1%，方法灵敏度高，稳定性好。
采集21份小吃店里油炸过油条、土豆、肉制品的煎炸油样品进行检测，苯并(a)芘的检出率为100%，含量为2.82～9.23 μg·kg-1。
关键词：高效液相色谱；苯并(a)芘；固相萃取Determination of Benzo(a)pyrene Content in Frying Oil byHPLCNI Han(Comprehensive Quality and Technical Supervision and Testing Center of Honghe Prefecture, Yunnan Province,Honghe 661100, China)Abstract: The content of benzo(a)pyrene (BaP) in frying oil was determined by HPLC, and the sample pretreatment method was optimized. The sample was extracted with n-hexane, purified by an SPE column, and detected by fluorescence detector. The results showed that the linear relationship of BaP was good within the mass concentration range of 0.5～20.0 μg·kg-1, with a correlation coefficient of R2=0.999 8 and a detection limit of 0.15 μg·kg-1 with a quantitative limit of 0.5 μg·kg-1. The average recoveries under three different spiking gradients at 89.1%～97.8%, respectively, RSD ranging from 0.8% to 2.1%. The method has high sensitivity and good stability.21 fried oil samples of deep-fried dough sticks, potatoes and meat products from snack bars were collected for detection. The detection rate of BaP was 100%, and the content range was 2.82～9.23 μg·kg-1.Keywords: high performance liquid chromatography; benzo(a)pyrene; solid phase extraction苯并(a)芘（Benzo(a)pyrene，BaP）是毒性最强的多环芳烃类物质[1-2]，食品在油炸、煎烤、熏制等烹调加工过程中，其脂肪、蛋白质、胆固醇、碳水化合物等营养成分会在高温条件下发生热裂解反应，再经过环化和聚合反应生成包括BaP在内的多环芳烃类物质。
《植物油苯并（a）花测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法》标准编制说明书1工作简况1.1任务来源根据CSTM标准委员会2021年7月30日材试标字[2021] 180号文件关于CSTM标准签发的立项通告，批准CSTM标准《植物油中苯并（a）花快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法》立项，立项编号为：CSTMLX 9900 00754-2021,英文版立项编号为：CSTM LX 9900 00754-2021 E,标准项目由CSTM/FC99综合标准领域委员会归口管理，由岛津企业管理（中国）有限公司负责牵头起草。
1.2主编单位协作单位标准计划中的负责起草单位为岛津企业管理（中国）有限公司，由岛津企业管理（中国）有限公司具体承担标准起草工作。
主编单位：岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司、中粮集团。
1.3主要工作过程2021年6月8日由岛津企业管理（中国）有限公司组织粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司等单位成员成立了标准编写工作组暨第一次工作组会议，开始进行标准草稿的编写工作，确定了标准制定方案和时间安排，并进行了工作划分，岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院主要负责国内外苯并（a）花测试方法及相关标准制修订情况的调研工作，完成植物油中苯并（a）在快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法标准草案起草工作，钢研纳克检测技术股份有限公司负责制定试验方案、准备试验样品。
2021年7月13日标准编写工作组在钢研纳克检测技术股份有限公司召开了第二次工作组会议，首先对标准文本草案进行了讨论和修改，初步确立了标准草案，然后根据标准草案对试验方案进行了讨论和完善，决定开始进行试验验证工作。
2021年7月13日-2021年11月1日由岛津企业管理（中国）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院、钢研纳克检测技术股份有限公司等单位进行了试验验证工作。
工作组对实验数据进了汇总统计，初步确定了标准的各项技术参数。
2021年11月初标准编写工作组再次对标准文本进行了修改，并开始编写标准编制说明和试验验证报告。
1.4本标准主要起草人:2 .标准化对象简要情况及标准制修订原则2.1标准化对象简要情况3, 4-苯并花（即苯并（a）花）被世界卫生组织列为一类致癌物，与人体DNA共价结合后可引起复制错误从而极易引发癌变。
一般认为在油脂的高温工艺过程中由多环芳煌通过组合、重排产生。
此外，在储存、运输或包装的过程中也易受外源污染。
我国GB 2762-2017 中针对部分谷物及其制品、熏烧烤肉类、熏（烤）水产品、油脂及其制品中污染物质苯并 W花的限量进行了规定，其中针对油脂及其制品为IOUg∕kg,欧盟、韩国、西班牙等规定油脂中苯并（a）花含量不得超2ug∕kg,国际食品法典委员会（CAC）也规定了食用油中苯并W花最高限量为5ug∕k g0因此准确测试食品中苯并⑸花的含量，对食品安全的管控显得尤为重要。
2. 2标准制定的必要性分析1）目前食用油中苯并（a）花检测手段主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱-荧光法和酶联免疫吸附法。
当采用色谱法进行分析时，上机之前，需要对食用油样品中苯并（a）花进行提取，对样品进行净化。
前处理手段主要包括液液萃取、索氏提取和固相萃取等方法。
其中，固相萃取结合液相色谱荧光检测法对干扰基质净化能力好，检测灵敏度高，作为国际标准方法ISOI5302-2017和国标方法GB5009. 27-2016被广泛使用。
但是现有标准中的固相萃取的前处理手段，操作步骤仍然繁琐费时，对实验人员技术水平要求较高，无法满足快速准确检测的需求。
而且仍然需要使用大量有毒有害化学试剂，不仅成本高，而且不环保。
本项目通过采用先进环保的超临界流体色谱分离技术，实现了植物油样品的在线净化和苯并（a）花的快速自动化检测，而且降低了样品前处理过程中有机溶剂的使用成本，为植物油当中苯并（a）花的快速监测和植物油的质量管理提供了有力的工具。
此外，该方法准确可靠，具有普遍适用性，易于推广使用。
2.3标准制修订的原则2）标准的编写格式按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T 20001.4标准编写规则第4部分：试验方法标准的统一规定和要求进行编写。
3）本标准采使用超临界流体色谱（SFe） -反相液相色谱（RPLC）二维系统对苯并（a）花样品溶液进行在线超临界流体色谱分离净化后，用中心切割的方式将苯并（a）花导入到第二维的反相高效液相色谱系统进行分离，荧光检测器检测，外标法定量。
1.1用国际标准和国外先进标准的情况，我国标准同被采用标准、和/或与国际、国外同类标准的主要差异及其原因，或与测试的国外样品的有关数据对比情况现有的国际标准为ISc） 15302： 2017动植物油脂苯并（a）花的测定反相高效液相色谱法（Animal and vegetable fats and oils - Determination of benzo [a] pyrene - Revers-phase high performance liquid chromatography method） o 国家标准 GB/T 22509-2008《动植物油脂苯并（a）花的测定反相高效液相色谱法》修改采用了 ISO 15302。
强制性国家标准GB 5009. 27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）花的测定》替代了 GB/T 22509-2008O 本标准在制定过程中参考了 GB 5009. 27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（a）花的测定》中试剂材料、色谱分析条件，ISO 15302动植物油脂苯并（a）花的测定反相高效液相色谱法（Animal and vegetable fats and oils - Determination of benzo[a]pyrene - Revers-phase high performance liquid chromatography method）,≠, 色谱条件、及精密度参数的规定。
本标准与ISo 15302： 2017、GB 5009. 27-2016比对情况见表L标准相比本标准采用了先进环保的超临界流体色谱分离技术，取代了采用氧化铝住或中性分子印迹柱对植物油中苯并（a）花进行分离提取的前处理过程，有效减少了有机溶剂的使用，降低了标准方法对操作人员的技术要求，提高了方法标准的可操作性，给出了详细的精密度数据，能够有效保证检测结果的准确度、可靠性和可重复性。
1.2准主要内容1.31标准名称本标准立项名称为植物油中苯并(a)花快速自动化测定法-超临界流体色谱在线净化法》，在编制过程中标准编写工作组决定采用符合GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1 部分：标准的结构和编写规则》要求的三段式写法，将标准名称变更为《植物油苯并(a) 花测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法》(VegetabIeOiIS—Determination of benzo(a)pyrene-Reverse phase High performance liquid chromatography method with on-line supercritical fluid chromatography clean up) 04.2适用范围1)本标准在制定过程中，采用该标准方法对市场上流通的20多种主要植物油进行了测试，并对数据进行了汇总处理分析，验证了本标准适用于植物油中苯并(a)花的测定。
2)经过前期试验验证采用超临界流体色谱在线净化•反相高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)花含量具有较宽的线性范围。
通过加标回收试验证明了本方法在0.5 μ g∕kg~50 μ g/kg测试范围内具有良好的准确度和可靠性，详见验证报告。
4.3原理使用高压切换六通阀将超临界流体色谱(SFe)与液相色谱(LC)联用，配合荧光检测器，进行植物油样品的在线净化和其中苯并(a)花的检测定量。
样品分析主要分以下三步完成。
(1)当六通阀处于图1 (a)所示位置时，Diol柱通过六通阀直接和背压控制器BPR 连接，正己烷稀释后的植物油样品通过自动进样器注入，在超临界二氧化碳流体和夹带剂甲醇的共同作用下，弱极性的苯并(a)花被保留在Diol柱上，非极性的脂质被优先洗脱下来，通过BPR流入废液。
(a)(b)(c)图1 SFC-LC植物油中苯并（a）花检测原理示意图（2）在苯并（a）花即将从Diol柱中溶出时，六通阀的位置切换至图1 （b）所示位置。
此时，DiOI柱通过六通阀与C18预处理小柱串联后，进一步和BPR进行连接。
使用甲醇将苯并（a）花从DiOl柱中洗脱下来，进入到C18预处理小柱中并被保留。
在这个过程中，系统中的超临界二氧化碳流体被优先洗脱到废液当中。
（3）在苯并（a）花即将从C18预处理小柱中溶出时，六通阀切换至图I（C）所示位置。
此时，C18预处理小柱和C18分析柱串联，在第二维的分析流动相的作用下，苯并（a）花从预处理小柱进入到分析柱中，与杂质进行分离后，使用荧光检测器检测。
4.4仪器设备-------------- 90%CHSCN 图2超临界流体色谱在线净化.反相高效液相色谱联用装置图检测仪器采用超临界流体色谱-反相液相色谱二维色谱系统，并配有荧光检测器。
使用高压六通阀，可以将市售的超临界流体色谱仪和液相色谱仪按照图2所示连接成二维色谱系统，用于该标准方法。
4.5仪器参考条件（此处关于色谱条件的选择和确定应详细描述，例如：流动相配比、切换时间、流动相流速是如何确定的？）本项目在开发阶段，针对色谱分离条件，检测条件等进行了考察和优化。
首先，针对超临界流体背压调节器（BPR）的参数设定，本实验采用了厂家的推荐条件。
荧光检测器的激发波长和发射波长，参考了 GB 5009.27的检测条件。
对色谱柱的类型和规格，流动相的条件，阀切换的时间等分析条件通过实验进行了考察和优化。
该标准同时使用3支色谱柱,分别进行植物油的超临界流体色谱在线净化,系统中CO2 超临界流体的去除，以及苯并（a）花的分离和检出。
其中，在选取SFC净化柱时，在DiOI 柱，SiliCa柱和NH2柱三种不同填料中进行选择，发现DioI柱保留更强，由此推断其净化能力更好，最终选择DioI 填料柱作为SFC净化柱。
另外，C18预处理小柱选用了柱长为 5cm的且对苯并（a）花保留能力强的C18填料柱。
最终的分析柱同样选用了碳含量高，对多环芳嫌保留强的C18分析柱进行分离。
并且为了提高检测灵敏度,选用了内径为2.1mm 的色谱柱。
