PSAG12-ipt基因转化植株研究进展张根良1,2 王文泉2(1华南热带农业大学农学院, 儋州571737;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口571101)摘要: 叶片衰老是一种程序性死亡过程; ipt ( isopentenyl transferas ) 基因转化植株, 可以催化调控内源细胞分裂素合成, 延缓转化株叶片衰老。
SAG12 基因启动子能够控制ipt 基因在植株下部衰老叶片中表达。
介绍了ipt 基因和SAG12 基因启动子的来源和应用, 以及PSAG12-ipt基因的产生和转化植株在国内的研究概况。
关键词: SAG12 ipt 细胞分裂素叶片衰老叶片衰老是一种典型的细胞程序性死亡, 它表现在叶绿素、脂类、蛋白质和RNA 的减少, 有助于提高植物的适应性; 它可以作为作物选择的一个重要指标来增加作物的遗传改良潜力。
目前, 对于叶片衰老的机制已经在生理生化、分子水平得到一定的阐明, 获得了一些与衰老有关的基因。
并且发现在衰老进程中, 植物激素, 包括生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和细胞分裂素起着非常重要的作用。
其中, 细胞分裂素作为植物衰老过程中的一个关键因子得到了广泛的关注。
已有研究通过转化ipt 基因增加植物内源的细胞分裂素, 可以延缓植物叶片的衰老, 增强植物对非生物逆境的抗性。
ipt 基因来源于土壤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 的Ti 质粒, 编码一种异戊烯基转移酶, 催化和调控细胞分裂素的合成。
Medford( 1989) 等[1]利用ipt 基因转化烟草和拟南芥, 用来源于玉米的hsp70 作为热诱导启动子,调控ipt 基因的表达, 受热激诱导后的转基因植物表现出叶片衰老的延迟, 细胞分裂素显著增加, 但没有诱导的转基因植物在细胞分裂素增加后, 出现了许多影响生长和发育的有害症状, 如侧芽的脱落, 茎杆和叶面积的减少, 根生长的停止等。
Gan 和Amasino( 1995)[2]采用了一种全新的策略来转化ipt基因, 利用细胞分裂素的自调控来减缓转基因烟草叶片的衰老, 而不改变其它的表型性状; 转化的ipt基因处于高度特异的-与衰老相关启动子SAG12 的控制之下, 融合的PSAG12-ipt 基因只在衰老的底部成熟叶片中表达。
简要介绍了ipt基因编码特性和SAG12 启动子在ipt 表达中的作用, 以及表达基因在转化植株中的应用。
1 叶片抗衰老基因ipt 的产生和作用植物激素在植株生长和发育中具有重要的作用, 其中细胞分裂素参与了细胞分裂的调控、延缓衰老和促进侧芽的生长; 这使研究学者试图通过改变内源细胞分裂素含量来控制这些过程。
但是植物本身的细胞分裂素合成相关基因并没有分离得到,使得根癌农杆菌中的ipt 基因得到了广泛的关注。
1984 年Akiyoshi 等从根癌农杆菌中将编码异戊烯基转移酶( ipt)的基因分离了出来, 并阐明了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成步骤中的一个关键限速酶, 它促使△2-磷酸PPi 与AMP 结合形成磷酸AMP, 接着被快速转化成异戊烯基腺苷和异戊烯基腺嘌呤; 经过细胞分裂素氧化酶作用最终分别形成玉米素核苷和玉米素ipt 基因从农杆菌中分离, 导入植物基因组中所产生转基因植株, 观察发现组织细胞分裂素含量增加, 叶片衰老延迟。
但是植株形态也发生了变化; 例如转基因植株芽不萌发, 没有顶端优势, 叶片小而圆, 不形成根等。
引起这些变化的主要原因就是ipt 基因在植株中的表达没有控制, 使细胞分裂素合成过剩, 从而影响了植株的生长。
为了解决植物组织中细胞分裂素过量表达的问题, 研究学者用了许多组织特异性启动子和可诱导启动子来表达外源ipt 基因, 如热激启动子、铜诱导启动子等, 均获得了相应的抗衰老植株; 这些转基因植株能够产生正常的根系, 但植株通常矮小, 并且有大量腋生芽。
激素分析显示, 转基因植株内的激素水平仍高于对照植株的激素水平。
这些研究仅局限于实验室, 限制了抗衰老遗传转化工程在农业生产上的应用。
2 SAG12 启动子在转ipt 植株中的应用1994 年Lohman 等从拟南芥中分离得到一组衰老相关基因( SAGs) , 研究证明其中编码半胱氨酸蛋白酶的SAG12 基因表达产物只存在植物下部衰老叶片中, 在嫩叶中并没有发现。
说明SAG12 具有高度的衰老特异表达特性。
SAG12 基因启动子( PSAG12) 活性受到叶片衰老过程和细胞分裂素含量的调控。
当叶片开始衰老、细胞分裂素含量下降时, PSAG12 被激活, SAG12 基因表达; 随着叶片细胞分裂素含量的增加, 叶片衰老进程被抑制, PSAG12 又逐渐被抑制。
因此, 人们开始利用PSAG12 来控制ipt 基因的表达。
根据PSAG12 衰老特异表达特性, 使ipt 基因在PSAG12 驱动下在植物衰老叶片中表达, 有效调控内源细胞分裂素含量, 在不影响植株正常发育的前提下, 达到延缓叶片衰老的目的。
1995 年Gan 等把SAG12 特异启动子与ipt 构建形成PSAG12-ipt 嵌合基因, 通过根癌农杆菌介导转化烟草获得转基因植株。
经研究发现这种新型转基因植株与野生型相比, 叶片衰老明显延迟, 花数和生物量也有所增加; 但形态方面无明显差别, 根系发育完全, 顶端优势得到保持, 在生理方面也表现出光合作用延长。
同时, 还对PSAG12-ipt 和PSAG12-gus转化株的GUS 活性进行了比较。
结果表明, 前者的GUS 活性的提高明显比后者缓慢, 说明PSAG12-ipt 自调控系统确实起到了自动调节的作用。
PSAG12-ipt 自调控系统具有低水平表达、自动调节表达的优点, 不需要耗费巨大的人力物力, 就可能实现延缓作物衰老, 提高产量。
这些都为转基因植株农业推广奠定了基础。
3 PSAG12-ipt 转化植株和衰老调控编码细胞分裂素生物合成限速步骤合成酶———异戊烯基转移酶( isopentenyl-transferases) 的基因首先在根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中得到鉴定,被称为ipt基因。
随着拟南芥(Arabidopsis)基因组测序工作的完成, 对ipt 基因又有了新的了解。
研究表明, 拟南芥的异戊烯基转移酶是被一个小的多基因家族编码, 其结构与细胞腺苷酸异戊烯基转移酶和tRNA 异戊烯基转移酶相似。
进行基因产物的生化分析还揭示了ADP 和ATP 是反应的优先底物[11]。
在对植物叶片衰老研究过程中, 根据差异筛选和减扣杂交等检测手段, 发现衰老叶片的RNA 总量下降, 特别是rRNA 水平剧烈下降[12]。
相反, 某些基因则在衰老开始后, 表达量反而逐渐升高; 这类基因被称为SAG 基因。
目前已经从拟南芥等植物中克隆出了大约30 多中SAG 基因, 但只有其中一小部分表现出高度的衰老特异性, 如从拟南芥中克隆出的SAG12、SAG13[10]和从欧洲油菜( Brassicanapus) 中克隆出的LSC54 。
这些基因的功能有的已经被证实与衰老细胞内的大分子物质的降解转运有关, 如编码核酸酶、蛋白酶、酯酶、谷氨酰胺合成酶等的基因。
用带有来源于拟南芥的衰老相关基因SAG12启动子和新霉素磷酸转移酶( NPT II) 选择基因的双元质粒作为载体, 将克隆自土壤农杆菌Ti 质粒的ipt 基因导入双元质粒构建表达载体。
利用构建的含ipt 基因的表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法等途径转化植株, 按照规定的程序获得转基因株系[14]。
获得的转基因植株还要通过PCR、Southern杂交等对所转ipt 基因的稳定性进行检测; 通过GUS活性和细胞分裂素含量分析, 证明抑制衰老的自我调节系统在转基因植株中得到表达。
当叶片开始衰老时, SAG12 基因启动子( PSAG12)被激活, 表达ipt 基因合成细胞分裂素; 通过细胞分裂素抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性, 延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解; 同时细胞分裂素可促使营养物质向应用部位移动。
4 PSAG12-ipt 对植株的生理影响PSAG12-ipt 转基因植株除了延缓下部叶片衰老外, 其他形态学和野生型对照基本相同, 如株高、叶型、侧芽萌发等。
但是转基因植株种子萌发和幼苗生长相对比较缓慢。
这可能是由于在植株早期生长时, 所转基因被激活所引起的。
研究还发现, PSAG12-ipt 转基因植株茎干变粗, 茎干内部的水含量也相应增加。
已知细胞分裂素可以增加内部还原性糖的含量[15]。
因此, 这些还原性糖的积累可能会导致渗透压的增加, 促使植物吸水和细胞膨胀, 最终使得茎干变粗和茎干内水量增加。
已有研究表明, 植物中细胞分裂素的积累与植物的N 状态紧密相关[16]。
但是缺氮对PSAG12-ipt 植株并没有太大的影响。
在缺少氮和硝酸盐的条件下,植株仍然保持绿色。
研究表明, 转基因植株生长培养基去氮5~10d 后, 检测发现植株内氮含量减少了70%, 但并没有显著抑制植株的生长, 也没有发现黄化的叶片[17]。
PSAG12-ipt 的这种反作用为作物育种提供了一个新的机遇。
转PSAG12-ipt 基因还可以延缓由水涝胁迫所引起的衰老[18]。
当水涝胁迫消除后, 转基因株系糖、叶绿素、细胞分裂素和脱落酸的恢复都比野生型迅速; 转基因植株根部细胞分裂素积累更快。
5 PSAG12-ipt 基因转化植株在国内的研究国内对作物衰老调控的研究, 以前一直局限在宏观上。
随着国外PSAG12-ipt 基因的产生和应用, 近几年国内也对此基因进行了植株转化和利用, 并在作物遗传育种上取得了可喜的成绩。
1998 年付永彩等[19]利用基因枪法把带有特异衰老基因SAG12 启动子的ipt 基因导入水稻, 并用PCR、Southern 杂交等证明外源基因稳定性。
通过GUS 活性、细胞分裂素含量的分析以及T1 代转基因植株成熟期的形态观察, 证明PSAG12-ipt 基因在部分转基因水稻中表达, 叶片衰老受到明显抑制。
随着研究的深入, 国内通过对青菜[20]和油菜[21等植株的基因转化, 都证实PSAG12-ipt 延缓叶片衰老, 增长叶片利用光能的时间, 使之积累了大量的光合产物。
通过对转PSAG12-ipt 基因水稻叶片中叶绿体的类囊体、嗜锇体等超微结构变化研究[22], 也说明叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt 在转化植株中的表达可明显延缓叶片衰老, 较长时间保持叶片绿色。
2004 年奚亚军等[23]利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt 导入普通小麦, 获得了 2 株叶片早衰现象得到明显改善的转基因植株。
