金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术

实验金黄色葡萄球菌的检验实验5金黄色葡萄球菌的检验1目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。

此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。

因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。

绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA 酶。

3实验材料3.1检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。

3.3培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。

3.5仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。

4检样程序5操作步骤5.15.1.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。

若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。

5.1.2增菌和分离培养将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。

金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

一、实验目的1. 熟悉金黄色葡萄球菌的基本生物学特性。

2. 掌握金黄色葡萄球菌的分离、纯化及鉴定方法。

3. 了解金黄色葡萄球菌的致病性及防治措施。

二、实验原理金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于自然界和人类及动物体内。

该菌具有高度的致病性，可引起多种化脓性感染，如肺炎、败血症、心内膜炎等。

实验中，通过观察金黄色葡萄球菌的形态特征、生化反应和药物敏感性，实现对金黄色葡萄球菌的鉴定。

三、实验材料1. 金黄色葡萄球菌菌种：购自某生物技术公司。

2. 实验器材：显微镜、无菌操作台、接种环、接种针、无菌培养皿、营养琼脂、血液琼脂、药敏纸片、生理盐水、75%酒精、碘酒、显微镜油镜等。

3. 实验试剂：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素等药敏纸片。

四、实验方法1. 金黄色葡萄球菌的分离与纯化（1）接种：将金黄色葡萄球菌菌种接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。

（2）挑取单菌落：用接种环挑取生长良好的单菌落，接种于新的营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。

（3）重复挑取：继续挑取单菌落，直至获得纯化后的金黄色葡萄球菌。

2. 金黄色葡萄球菌的形态特征观察（1）革兰氏染色：将纯化后的金黄色葡萄球菌涂片，进行革兰氏染色，显微镜下观察。

（2）菌落观察：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时，观察菌落形态。

3. 金黄色葡萄球菌的生化反应鉴定（1）糖发酵实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于糖发酵培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生气泡。

（2）氧化酶实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于氧化酶培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生颜色变化。

4. 金黄色葡萄球菌的药物敏感性实验（1）药敏纸片法：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，将药敏纸片贴于平板表面，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。

（2）最低抑菌浓度（MIC）测定：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于微量肉汤稀释法培养基，分别加入不同浓度的药物，37℃恒温培养24小时，观察生长情况，确定最低抑菌浓度。

实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇）1 目的1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法2 原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。

可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。

如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。

金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。

这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。

3 材料3.1 样品奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。

3.2 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）3.3 培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。

3.4 其它显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。

4 流程5 步骤5.1 一般培养称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。

吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。

同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。

置36±1℃温箱培养24h。

5.2 分纯培养将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。

若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。

金黄色葡萄球菌检验1. 概述金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的细菌，广泛存在于自然环境和人体皮肤表面。

虽然大多数的金黄色葡萄球菌对人体无害，但一些菌株具有致病性，可以引起多种感染，包括皮肤感染、肺炎、血流感染等。

因此，对金黄色葡萄球菌的检验具有重要意义，能及早发现和控制感染的传播。

本文将介绍金黄色葡萄球菌检验的一些常用方法和技术。

2. 菌种的采集和处理2.1 采集样本金黄色葡萄球菌通常从病人的感染部位或者其他潜在的感染源采集样本。

常见的样本类型包括：皮肤切口分泌物、鼻拭子、血液、尿液等。

2.2 样本处理在进行金黄色葡萄球菌的检验之前，需要对采集的样本进行适当的处理。

处理方法取决于样本的类型和检验的目的。

常见的处理步骤包括：•鼻拭子：将鼻拭子放置在含有缓冲液的管中，将管子旋紧，并轻轻摇动一段时间，使细菌尽可能地释放到缓冲液中。

•血液：采集静脉血样本，将血液转移到无菌包装的管中，并立即将管子送到实验室进行处理。

•皮肤分泌物：使用无菌棉签或拭子采集患者分泌物，放入管中并送到实验室。

3. 常用的金黄色葡萄球菌检验方法3.1 培养方法金黄色葡萄球菌通常通过培养方法来进行检验。

常用的培养基包括牛肉肝脏套，Columbia血琼脂和Mannitol盐琼脂。

在封闭器具中加热灭菌后，将菌种均匀涂布于培养基上，并在适宜的温度（通常为37摄氏度）下孵育24-48小时，观察是否有金黄色小圆菌落的形成。

3.2 利用PCR技术检测PCR（聚合酶链式反应）是一种敏感且快速的方法，可以检测金黄色葡萄球菌的DNA。

通过PCR技术，可以快速鉴定金黄色葡萄球菌的存在和菌株的特性。

这种方法特别适用于高致病性金黄色葡萄球菌的检测。

3.3 人类源金黄色葡萄球菌的毒力基因检测金黄色葡萄球菌通常通过其特有的毒力基因来引起感染。

通过PCR技术，可以检测和鉴定菌株中的毒力基因。

常见的毒力基因包括PVL、TSST-1、ETA等。

1.血浆凝固酶试验：原理:金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝集颗粒；游离型的血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。

大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。

因此，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。

葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合凝固酶（用玻片法测试），另一种是游离凝固酶（用试管法检测）。

方法：（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。

（如出现颗粒状凝集现象即为阳性。

如不立即发生凝集，可稍待一，二分钟，并轻轻摇动玻片，加速反应，若无凝集时则为阴性。

）（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml 待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。

），混匀后置37℃水浴中，每30min 观察1次结果。

若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。

（观察结果，将试管微微倾斜，血浆成冻胶样凝块者为阳性，血浆仍为液状者为阴性。

）【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。

（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。

4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。

【注意事项】（1）最好使用EDTA抗凝的兔血浆，因为如果使用枸缘酸盐抗凝血浆会产生假阳性结果（2）玻片法：10秒内观察结果，如超过10 秒可出现假阳性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

2. 耐热核酸酶试验原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上6-8个孔径为2-5mm的小孔，各孔分别加一滴经沸水浴3分钟处理过的待检葡萄球菌和阳性阴性对照葡萄球菌培养物，35℃大气环境孵育3小时，观察有无粉红色圈及其大小。

金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。

普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。

二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。

三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。

1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。

金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。

3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。

金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。