锰过氧化物酶(Mnp)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

过氧化物酶（POD）活性测定一、原理：过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。

本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。

二、实验准备：仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml 容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子试剂：0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水试剂配制:○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。

○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。

○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。

三、步骤：○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。

○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录2 min ，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。

一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。

二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。

在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。

反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。

愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。

将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。

2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。

取出试管，立即放入冰浴中终止反应。

使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。

3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。

根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。

过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL 。

过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC0090规格：50T/48S 产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体0.33mL×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL 试剂一；用不完的试剂4℃保存一周；试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

产品说明：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

POD 催化H 2O 2氧化特定底物，在470nm 有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、二和三37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min。

3、样本测定表试剂名称（µL）测定管样本15蒸馏水270试剂一520试剂二130试剂三135在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s 后的吸光值A2。

木质素过氧化物酶（Lip ）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：UPLC-MS-4257规格：50T/48S紫外分光光度法产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件试剂一液体85mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体11mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体6mL×1瓶2-8℃保存产品说明：木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip ）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。

Lip 在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。

藜芦醇可以被Lip 催化发生氧化反应，其产物藜芦醛在310nm 处有最大吸收峰，以藜芦醇为反应底物，通过测定310nm 处藜芦醛的吸光值，可以判定Lip 的酶活性。

Veratryl AlcoholLip Veratraldehyde (310nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照样本质量（g ）：试剂一体积（mL ）为1:5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4℃离心10min ，取上清置冰上待测。

2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL ）为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W ，超声3s ，间隔7s ，总时间3min ），10000g 4℃离心10min ，取上清置冰上待测。

过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.00.00.0酶液 (ml)0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD总活性[u/g(FW)]=FWtV.VA T⨯⨯⨯⨯147001∆式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。

检测试剂盒(愈创木酚比色法)说明书
4ml预冷的PODLysisBuffer研磨或匀浆，4 POD粗提液，-20℃冻存，用于过氧化物酶的
A测定0=加入PODAssaybuffer工作液后立即测定的测定孔吸光度值t=反应时间(min)=3
注意事项：
1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、POD酶液提取时注意低温操作，防止酶活性。

3、以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。

4、POD氧化剂和POD终止液具有一定腐蚀性，请小心操作。

5、POD氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。

6、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9 ml磷酸缓冲液1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）1 ml H2O20.1ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。

在470nm处测OD470。

5、结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。

即酶活力=OD×D / 0.01t酶的比活力= OD×D /（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。

即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。

2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9 ml磷酸缓冲液1 ml 儿茶酚溶液0.1 ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。

（3）过滤，适当稀释。

锰超氧化物酶Mn-SOD
锰超氧化物酶(Mn-SOD)是一种重要的酶类，能够在自由基反应中作为一种抗氧化剂进行保护作用，防止细胞和组织器官的损伤和疾病发生。

本文将从锰超氧化物酶的定义、特性、功能及应用等方面进行450字的详细介绍。

1. 锰超氧化物酶的定义
锰超氧化物酶(Mn-SOD)是一种四聚体酶，其分子量大约为80kDa。

与其它超氧化物酶相比，锰超氧化物酶是最早被发现和研究的一种，它是细胞内最重要的超氧化物歧化酶之一。

2. 锰超氧化物酶的特性
锰超氧化物酶富含在线粒体、细胞质和细胞核等部位，其中除了细胞核内相对较少。

它的基本特性在于它所用的金属离子是锰离子，而不是铜离子或铁离子等其他超氧化物歧化酶所使用的金属离子。

3. 锰超氧化物酶的功能
锰超氧化物酶的主要功能在于对细胞内的超氧阴离子(O2−)进行歧化作用，将其转变为较为对细胞不具有氧化作用的H2O2，防止其对细胞和组织器官的损伤和疾病发生。

此外，锰超氧化物酶还能够抑制乳酸脱氢酶等一些蛋白质的氧化作用，从而发挥一定的蛋白质保护作用。

4. 锰超氧化物酶的应用
锰超氧化物酶已经被广泛地用于研究一些生物学过程的机制，例如：癌症、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病等的发生与发展过程。

同时，它也被广泛应用于医学诊疗中。

例如，它可以用于治疗以缺氧为特征的脑损伤、心肌梗死和其他疾病。

总之，锰超氧化物酶是一种重要的酶类，它能够在细胞内对超氧阴离子进行歧化作用，起到抗氧化剂的保护作用。

它的研究和应用对于维护人体健康具有重要意义。

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC0190规格：50T/24S产品简介：PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在410nm有特征光吸收。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存，用前混匀；试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。

操作步骤：一、粗酶液提取：1.收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2.称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定操作表：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一600600试剂二150150样本150煮沸的样本15037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。

冷却后，5000g，常温离心10min，收集上清，用蒸馏水调零，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。

注意:每个测定管需要设置一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5 min沸水浴处理。

PPO活性计算：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。