躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

神经导管修复大鼠坐骨神经缺损实验研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：张凤久赵志英刘启黄丽华【摘要】目的：采用一种自行研制的具有良好生物相容性的壳聚糖构建人工神经来修复大鼠坐骨神经缺损,研究证实其修复效果。

方法：选用30只健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组（A组）、原位神经移植组（B组）、壳聚糖神经导管桥接组（C组)3组，分别切断坐骨神经后做相应处理，12周后进行神经电生理检测。

结果：C组12周后神经已经长过缺损段,神经传导功能恢复。

结论：这种套管能够有效的桥接10 mm长的大鼠坐骨神经缺损，可应用于周围神经缺损的治疗，同时可以作为进一步开发组织工程化的人工神经的良好载体。

【关键词】神经导管；周围神经；缺损；壳聚糖Abstract Objective: Using a self-developed chitosan with good biocompatibility to build artificial nerves to repair defects in rat’s sciatic nerve and a study was made to confirm the repair effect. Methods: 30 healthy male Wistar rats wererandomly divided into 3 groups (A: normal control group, B: in situ nerve graft group, C: Artificial neural bridge group). Sciatic nerve were cut off with the deal accordingly, 12 weeks later, the nerve electrophysiological testing was performed. Results:12 weeks later, the nerve has been a long paragraph defect, the function of nerve conduction recovered. Conclusion: This casing can effectively bridge the Sciatic Nerve defect of 10mm in rats and can be used in the treatment of peripheral nerve defects. At the same time it can serve as a good carrier for the further development of tissue-engineered artificial nerves.Key words Nerve conduit; Peripheral nerve; Defect; Chitosan周围神经损伤在临床中非常多见,在很多情况下,易导致长期且严重的功能障碍。

壳聚糖及其衍生物在神经组织工程中的研究进展唐大川【期刊名称】《中华实验眼科杂志》【年(卷),期】2014(032)008【摘要】壳聚糖(CS)是一种来源丰富、经济实用的天然阳离子多糖类聚合物,研究表明其具有无毒性、可降解性、可塑性以及良好的生物相容性等特点,可用于组织损伤的修复和作为生物载体支架等,并具有神经保护作用.近年来,研究者将CS进行结构上的修饰,或者与不同物质进行混合,制备成各种适用的复合物或生物载体,为组织的重建、神经干细胞(NSCs)的培养和组织缺损的修复提供三维空间构架.此外,由CS形成的组织工程生物材料的物理性能更优良,生物学功能更多样,促进神经再生的作用更明显,因此预测在临床上有较好的应用前景.就CS的基本特性、生物学功能和神经组织工程中的作用等研究进展进行综述.%Chitosan (CS) is known as a polysaccharide with positive charge and good biocompatibility.Researches showed that CS possesses the advantages ofnontoxicity,biodegradability,plasticity and good biocompatibility,and therefore it can be used to repair of neural injury and serve as a biological carrier scaffold in engineered nerve tissue.Recently,the research is performed for the modification of CS structure or mix the CS with different materials to prepare the multiple compound and biological vector to offer three-dimensional scaffold and environment for the reconstruction of defective neural tissue and culture of neural stem cells.In addition,CS engineered biological materials are confirmed to possess the betterperformance,more diverse functions and more dominant effect on the regeneration of neural tissue,so it is predicted a more extensive application prospect in neural repair and regeneration.The basic properties and biological functions of CS,and its application in neural tissue engineering are reviewed.【总页数】4页(P752-755)【作者】唐大川【作者单位】430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院超声影像科【正文语种】中文【相关文献】1.壳聚糖及其衍生物在神经组织工程中的研究进展 [J], 唐大川;杨红;2.两亲性壳聚糖衍生物在药物递送中的研究进展 [J], 田春莉;鞠曹云;张灿3.壳聚糖及其衍生物在天然织物整理中的应用研究进展 [J], 车秋凌;李明春;辛梅华4.两亲性壳聚糖衍生物在药物递送中的研究进展 [J], 田春莉; 鞠曹云; 张灿5.壳聚糖及其衍生物在硫化矿浮选分离中的研究进展 [J], 郝佳美; 刘建; 董文超; 曾勇; 文书明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

D O I :10.12083/S Y S J .2020.17.016㊃论著㊀科研之窗㊃基金项目:邯郸市科学技术研究与发展计划项目(编号:16232080634)作者简介:朱旭,E m a i l :1131352580@q q .c o m ә通信作者:于国渊,E m a i l :h d z x s w e @163.c o m胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤后运动功能恢复作用的实验研究朱㊀旭㊀于国渊ә㊀杨华堂㊀张㊀宁㊀王喜旺㊀王㊀晶㊀王如科邯郸市中心医院,河北邯郸056000ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨胶原-壳聚糖支架对脊髓损伤(s p i n a l c o r d i n j u r y,S C I )后运动功能恢复作用,为组织工程学在临床治疗脊髓损伤的应用奠定基础㊂方法㊀(1)制备胶原与壳聚糖配比为3：1的凝胶复合材料,置于真空冻干机冷冻干燥得到多孔可降解的胶原-壳聚糖支架(s c a f f o l d sS );(2)选取成年雌性S D 大鼠30只,体质量250~300g ,随机分为3组,暴露脊髓后未损伤脊髓为空白对照组(S HAM ),采用挂线法离断脊髓后未放入支架为离断损伤组(S C I )和采用挂线法离断脊髓后植入胶原-壳聚糖支架为支架组(S C I +S );(3)术后每周采用双盲法通过B a s s o -B e a t t i e -B r e s n a h a n (B B B )评分评价各组大鼠后肢运动功能的恢复;分别在术后即刻㊁术后1个月和术后2个月分别检测各组大鼠(n =5)双后肢运动电生理(m o t o r e v o k e d p o t e n t i a l s ,M E P )活动;(4)术后8周取材,石蜡切片观察H E 染色;冰冻切片观察神经丝蛋白(n e u r o f i l a m e n t ,N F )免疫荧光染色情况㊂结果㊀挂线法将缝合线穿过暴露的脊髓底部,提拉起脊髓后用手术剪刀离断,确保彻底离断脊髓组织㊂离断瞬间大鼠双下肢剧烈抽搐数次后各个关节松弛,无牵拉反射,提示造模成功㊂术后1个月和术后2个月,S C I +S 组大鼠的M E P 电生理活动㊁B B B 评分结果均明显优于S C I 组㊂H E 染色结果发现S C I +S 组损伤后形成的空洞明显少于S C I 组大鼠;N F 免疫荧光结果发现S C I +S 组相对于S C I 组更有利于脊髓损伤后的神经再生和修复㊂结论㊀孔胶原-壳聚糖支架减轻脊髓损伤后空洞的形成并促进神经纤维及轴突再生及后肢运动功能恢复,是一种具有良好应用前景的治疗脊髓损伤的支架㊂ʌ关键词ɔ㊀脊髓损伤;组织工程;胶原蛋白;壳聚糖;支架;运动功能恢复ʌ中图分类号ɔ㊀R -332㊀㊀ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀ʌ文章编号ɔ㊀1673-5110(2020)23-2032-07S t u d y o n t h e e f f e c t o f c o l l a g e n -c h i t o s a n s c a f f o l d s o nm o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r yZ HU X u ,Y U G u o y u a n ,Y A N G H u a t a n g ,Z HA N G N i n g ,WA N G X i w a n g ,WA N GJ i n g ,WA N GR u k e H a n d a nC e n t r a lH o s pi t a l ,H a n d a n 056000,C h i n a ʌA b s t r a c t ɔ㊀O b je c t i v e ㊀T o i n v e s t i g a t e t h e ef f e c t o f c o l l ag e n -chi t o s a n s c a f f o l do nm o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y a f t e r s p i n a l c o r d i n -j u r y (S C I ),a n d t o l a y a f o u n d a t i o n f o r t h e c l i n i c a l a p p l i c a t i o no f t i s s u e e n g i n e e r i n g i n t h e t r e a t m e n t o f s p i n a l c o r d i n j u r y .M e t h o d s C o l l a g e n -c h i t o s a n c o m p o s i t e sw i t h t h e r a t i oo f 3:1w e r e p r e p a r e da n d f r o z e n -d r i e d i nv a c u u mf r e e z e -d r ye r t oo b t a i n p o r o u s s c af -f o l d s (S ).T h i r t y a d u l t f e m a l eS Dr a t sw e ighi n g 250-300g w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s :c o n t r o l g r o u p (S HAM ),S C I g r o u p (S C I )a n dS C I +S g r o u p w h i c hw e r eo p e r a t e du s i n g t h r e a d -d r a w i n g m e t h o da n d t h e n i m p l a n t e dc o l l a g e n -c h i t o s a ns c a f f o l d i mm e d i a t e l y a f t e r s p i n a l c o r d e x p o s u r e .B a s s o -B e a t t i e -B r e s n a h a n (B B B )s c o r ew a s u s e d t o e v a l u a t e t h e r e c o v e r y o f h i n d l i m bm o t o r f u n c t i o n i n e a c h g r o u p e v e r y w e e k a f t e r o p e r a t i o n ,a n dm o t o r e v o k e d p o t e n t i a l s (M E P )a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i mm e d i a t e l y a f t e r o p -e r a t i o n ,1m o n t ha n d2m o n t h s a f t e r o p e r a t i o no f e a c h g r o u p r e s p e c t i v e l y .A f t e r 8w e e k s ,t h e r a t sw e r e s a c r i f i c e d .T h e s p i n a l c o r d w e r eb u r i e d i n p a r a f f i n s e c t i o na n d s t a i n e dw i t h H E .T h en e u r o f i l a m e n tN F i mm u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g w a so b s e r v e db y f r o z e n s e c t i o n .R e s u l t s ㊀T h r e a d -d r a w i n g m e t h o d e n s u r e d t h a t t h e s p i n a l c o r dw a s c o m p l e t e l y d i s c o n n e c t e d a n d t h e r e l i a b i l i t y of t h em o d e l i s e n s u r e d .A t t h em o m e n t o f a m p u t a t i o n ,t h em u s c l e s o f t h e h i n d l i m b s o f r a t sw e r e f l a b b y a f t e r s e v e r e c o n v u l s i o n s ,a n d t h e r ew a s n o r e t r a c t i o n r e a c t i o n a f t e r p a i n s t i m u l a t i o n ,s ug g e s t i n g th a t t h em o d e l o f t r a n s e c t e d r a t sw a s s u c c e s s f u l .T h e r e s u l t s o fM E Pe l e c -t r o p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y a n dB B B s c o r e i nS C I +S g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y b e t t e r t h a n t h o s e i nS C I g r o u p a t 1m o n t h a n d 2m o n t h s a f t e r o p e r a t i o n .H Es t a i n i n g s h o w e d t h a t t h en u m b e r o f h o l e s i nS C I +S g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a nt h a t i nS C I g r o u p ;N F i mm u n o f l u o r e s c e n c e s h o w e d t h a t S C I +S g r o u p w a sm o r e c o n d u c i v e t on e r v e r e g e n e r a t i o na n d r e p a i r a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r y t h a n S C I g r o u p .C o n c l u s i o n ㊀P o r o u s c o l l a g e n -c h i t o s a n s c a f f o l d c a n a l l e v i a t e t h e f o r m a t i o no f c a v i t y a f t e r s p i n a l c o r d i n j u r y ,p r o m o t e t h e ㊃2302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c .2020,V o l .23N o .23r e g e n e r a t i o no f n e r v e f i b e r s a n d a x o n s,a n d r e s t o r e t h em o t o r f u n c t i o no f h i n d l i m b s.I t i s a p r o m i s i n g s c a f f o l d f o r t h e t r e a t m e n t o f s p i n a l c o r d i n j u r y.ʌK e y w o r d sɔ㊀S p i n a l c o r d i n j u r y;T i s s u e e n g i n e e r i n g;C o l l a g e n;C h i t o s a n;S c a f f o l d s;M o t o r f u n c t i o n r e c o v e r y㊀㊀随着人类交通工具使用的不断增加,脊髓损伤(S C I)的发病率也与日俱增,S C I的高致残率给社会带来沉重的负担㊂脊髓局部不利于神经修复的主要原因是损伤后各种炎症因子的刺激,脊髓液化及空洞形成,胶质瘢痕增生及髓鞘抑制因子等共同作用导致㊂因此,S C I的治疗成为医疗界的一个巨大挑战[1-5]㊂最近研究表明,在给予足够的神经营养和适宜的生长环境下,破坏后的人类中枢神经系统可以缓慢的进行再生[6]㊂根据这项神经系统的特点,启发人们通过各种手段和方法来引导神经系统的再生,并且支持帮助神经轴突穿过损伤后的瘢痕组织,扭转抑制因子形成的微环境来治疗S C I㊂近年来,组织工程学支架的发展为脊髓的修复和再生提供了治疗思路[7-8]㊂利用组织工程仿生支架的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁,为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑;利用其生物相容性填补脊髓空腔;利用其低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境,减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[9-10]㊂目前该治疗方法以成为S C I研究的热点㊂另外,脊髓损伤后局部的病理生理及化学因素的改变对中枢神经的再次生长发育也起到了至关重要的作用㊂改善病理生理过程并帮助神经纤维抵抗各种炎性因子抑制是优质的支架材料必须具备的化学及生物特性[11]㊂众所周知,脊髓横断切断了大脑对脊髓的控制,导致对应的肢体运动功能和皮肤的痛温触觉及本体感觉的丧失㊂由于中枢神经系统的自我恢复能力和再生能力非常差,损伤后复杂的病理过程进一步增加了修复的难度㊂因此,S C I的致残率和致死率极高,临床治疗难度大,预后差㊂为神经的再次生长和发育提供营养支持,诱导神经纤维连接并形成完整的神经传导通路是目前探索治疗S C I的主要研究方向[12]㊂本试验通过大鼠B B B评分和电生理活动评价各组大鼠后肢运动功能的恢复㊁H E染色和N F免疫荧光染色观察支架修复脊髓损伤的效果㊂本研究运用胶原-壳聚糖支架移植到全横断脊髓损伤处,探讨这种支架对运动功能的影响,为临床治疗脊髓损伤提供依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀支架制备㊀选择新鲜牛肌腱,取剔除外膜及周围脂肪后剩余的结缔组织,用搅拌机充分研磨粉碎,在置入高速离心机离心之前先用0.05m o l/L T r i s 缓冲液浸泡10h,离心后可得到乳白色的混悬液,静置后收集沉淀㊂配置含有消化蛋白酶的醋酸溶液,持续搅拌至蛋白酶完全溶解㊂将醋酸溶液加入到收集的乳白色沉淀中,待沉淀充分溶后解取上清液㊂利用盐析法收集盐析出的沉淀物并在4ħ去离子水中充分清洗溶解,获得胶原蛋白凝胶㊂另外,将研磨后的壳聚糖粉末倒入醋酸溶液中,充分搅拌直至完全溶解,按壳聚糖ʒ胶原质量比1ʒ3的比例将溶有壳聚糖的醋酸溶液与胶原蛋白凝胶混合,充分搅拌后高速离心㊂去除上清液后在4ħ去离子水中充分清洗获得预胶化的混合材料,密封备用㊂将胶冻状的支架材料取出后置于实验型真空冷冻干燥机中24h得到固定形态的多孔隙的脊髓仿生支架㊂用1%的N a O H 溶液浸泡支架12h,反复冲洗,裁剪为3mmˑ3 mmˑ3mm的圆柱体,60C o灭菌后备用[13-14]㊂1.2㊀大鼠脊髓全横断模型的建立㊀本实验的大鼠由军事医学科学院动物饲养中心提供㊂将30只雌性S D大鼠适应性喂养1周,2d更换草料,充分喂食,术前禁食不禁水8h㊂采用腹腔注射麻醉,麻醉剂选择5%水合氯醛(7m L/k g)㊂待大鼠完全麻醉后俯卧固定㊂在背部皮毛上均匀喷洒适量酒精喷雾剂清洁背部,待毛发干燥后用电剃刀剃除背部毛发,暴露皮肤,碘伏常规消毒㊂触摸脊柱,确定T8-10棘突的位置,沿脊柱正中切开皮肤,切口约4c m,钝性分离脊柱两侧肌肉组织㊂用金属推开器推开双侧的肌肉组织,充分暴露T8-10棘突㊂止血钳提拉锥体,暴露脊柱间隙,利用咬骨钳咬开缺口并扩大,直至完全咬除对应的脊柱骨板,注意尽量沿正中方向咬除骨质暴露脊髓,避免损伤双侧静脉窦引起大出血,增加手术病死率㊂小鼠专用手术显微镜下用剪刀片沿正中划开脊髓的硬脊膜㊂将单根血管缝合线从脊髓底部穿过脊髓并提拉㊂眼科剪横断脊髓,大鼠双侧后肢抽搐数次后肌肉松弛无力,针刺无反应提示造模成功[15]㊂血凝酶减少出血,促进血液凝固,待术野完全干净后植入胶原-壳聚糖支架㊂术后大鼠分开低密度喂养,每日伤口碘伏消毒,腹腔注射青霉素预防感染,挤压膀胱辅助排尿,投放干果饼干等加强营养㊂加强手术切口护理,如出现伤口裂开及时处理,防止发生啃食现象㊂将实验动物随机分为3组,每组10只,分别为:(1)正常对照组(S H AM组);(2)单纯损伤组(S C I组);(3)胶原-壳聚㊃3302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23糖支架组(S C I+S组)㊂1.3㊀B B B㊀运动功能评分S C I术后每周在固定时间用B B B评分量表评估各组大鼠的双后肢运动功能[16]㊂1.4㊀电生理检测㊀分别于术后即刻㊁术后1个月和术后2个月分别检测各组大鼠(n=5)双后肢运动电生理(m o t o r e v o k e d p o t e n t i a l sM E P)活动㊂5%水合氯醛(7m L/k g)腹腔注射麻醉㊂麻醉后固定在手术台㊂去除毛发并消毒后沿正中矢状切开头部皮肤及双下肢测量电极放置区域的皮肤㊂参比电极沿肌肉走行插入㊂诱发电位仪通过刺激大鼠肌肉记录运动诱发电位(M E P)的潜伏期㊁波幅及波形㊂将刺激电极置于冠状缝和矢状缝交叉处的皮质运动区,记录电极放置于胫后神经,刺激后在电位仪上记录M E P潜伏期㊁波幅及波形㊂每组5只大鼠,取平均值㊂1.5㊀H E染色㊀造模后8周,将大鼠灌流后取出脊髓组织固定在4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋切片,后做H E(h e m a t o x y l i n e o s i ns t a i n i n g)染色㊂显微镜下观察脊髓断端瘢痕形成与修复及周围组织形态学的改变㊂经过P h o t o s h o p和I P P软件分析脊髓横断处再生的组织面积,得出脊髓损伤处的损伤修复程度百分比㊂1.6㊀N F免疫荧光染色㊀造模后8周,将所有实验大鼠T7~T12脊髓行神经丝蛋白-200(N F-200)的免疫荧光染色,确定神经纤维的再生情况㊂将固定处理好的脊髓标本组织进行冰冻切片㊂含T r i t o n-X 100的P B S常温透化处理20m i n,P B S缓冲液洗3次,5m i n/次㊂5%的B S A,室温孵育20m i n㊂滴加N F一抗,4ħ过夜,P B S缓冲液洗3次,5m i n/次㊂滴加相应二抗,37ħ避光孵育50m i n,P B S缓冲液洗洗3次,5m i n/次㊂封片剂封片,在荧光显微镜下观察㊂经过P h o t o s h o p和I P P软件分析经脊髓损伤处的荧光相对密度,从而计算脊髓损伤处N F的百分比㊂1.7㊀统计学分析㊀采用S P S S21.0软件进行数据处理,计量资料采用均数ʃ标准差(xʃs)表示,组间数据比较采用t检验和双因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀支架的外观㊀真空冷冻干燥机冷冻干燥后得到S支架(图1A)㊂冷冻干燥后S支架质地柔韧,尺寸与大鼠脊髓接近(图1B)㊂2.2㊀成功建立大鼠全横断损伤模型㊀图1C~F为造模的步骤㊂挂线法将缝合线穿过暴露的脊髓底部,提拉起脊髓后用手术剪刀离断,确保彻底离断脊髓组织㊂离断瞬间大鼠双下肢剧烈抽搐数次后各个关节松弛,无牵拉反射,提示造模成功㊂图1㊀A:直接冷冻干燥的胶原-壳聚糖支架;B:裁剪后的胶原-壳聚糖支架;C:暴露脊髓节段;D:挂线法;E:全横断脊髓后形成的空腔;F:植入支架F i g u r e1㊀A:D i r e c t f r e e z ed r y i n g o f c o l l a g e n-c h i t o s a ns c a f-f o l d;B:C u t i n t oc e r t a i ns h a p e;C:E x p o s u r eo fs p i n a lc o r d s e g m e n t s;D:H a n g i n g l i n e m e t h o d;E:T h ec a v i t y f o r m e d a f t e r c o m p l e t e t r a n s e c t i o no f t h e s p i n a l c o r d;F:S c a f f o l d i m-p l a n t a t i o n2.3㊀双后肢运动功能的恢复㊀术后1周,各组大鼠后肢功能无明显恢复,B B B评分组间比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂术后2周开始S C I+S组B B B 评分均明显高于S C I组,差异均有统计学意义(P< 0.05)(图2)㊂电生理是临床上被广泛认可的评价神经功能强弱的方法,根据神经传导的方向及功能分为测量运动功能的诱发电位;测量感觉功能的体感诱发电位㊂电位的潜伏期和振幅分别代表神经纤维传导的速度和兴奋性㊂该实验对脊髓损伤术后即刻㊁术后1个月和术后2个月后对各组大鼠进行电生理检测㊂从M E P 的波形图和统计图可以看出,在术后即刻S C I组和S C I+S的波形几乎检测不到(图3A~C)㊂在术后1个月和术后2个月,S C I组的潜伏期比S C I组的潜伏期明显更低(P<0.05)(图3A~B),S C I+S组的振幅比S C I组明显更高(P<0.05)(图3A和图3C)㊂㊃4302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23图2㊀S HAM 组㊁S C I 组和S C I +S 组大鼠造模后1~8周的B B B 评分值比较F i g u r e 2㊀T h ec o m pa r i s o no ft h eB B Bs c o r e so fs h a m g r o u p ,S C I g r o u p a n d S C I +s g r o u p d u r i n g 1-8w e e k s a f -t e rm o d e l i n g㊀图3㊀造模后即刻㊁术后1个月和术后2个月电生理检测㊀A :3组M E P 波形图;B :3组M E P 潜伏期;C :3组M E P 的振幅F i g u r e 3㊀E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n i m m e d i a t e l y ,1m o n t ha n d 2m o n t h sa f t e ro pe r a t i o n .A :W a v ef o r m so f M E P i n t h r e eg r o u p s ;B :L a t e n c y o fM E P i n th r e e g r o u p s ;C :A m p li t u d e o fM E P i n t h r e e g r o u ps 2.4㊀H E 染色㊀H E 染色显示脊髓仿生支架植入体内2个月后对脊髓损伤的修复作用㊂图4展示为H E 染色㊂S C I 组H E 染色大体图,脊髓断端有明显的瘢痕增生,脊髓神经元大量死亡丢失形成空洞(图4B 和图4E )㊂S C I +S 组织结构紧凑致密,修复作用明显优于S C I 组,瘢痕和空洞较少,S C I +S 结构完整性明显优于S C I 组(图4B ㊁图4E ㊁图4C 和图4F )㊂相比单纯损伤组,植入S 支架组明显增加脊髓损伤处的损伤修复程度百分比,有显著性差异(P <0.05)(图4F )㊂图4㊀造模后2个月的3组H E 染色㊀A ㊁D :S HAM 组的H E 染色大体图;B ㊁E :S C I 组H E 染色的大体图;C ㊁F :S C I +S 组H E 染色的大体图;G :3组脊髓损伤处损伤修复程度百分比F i g u r e 4㊀H E s t a i n i n g p e r f o r m e di nt h r e e g r o u p st w o m o n t h s a f t e rm o d e l i n g .Aa n dD :H Es t a i n e df o r t h e s h a m g r o u p ;Ba n dE :H E s t a i n e d f o r t h e S C I g r o u p ;Ca n dF :H E s t a i n e d f o r t h eS C I +S g r o u p ;G :T h e p e r c e n t a g eo f r e pa i r d e g r e e o f s p i n a l c o r d i n j u r y i n t h r e e g r o u ps 2.5㊀N F 免疫荧光染色㊀图5为脊髓全横断后2个月的N F 免疫荧光染色㊂S H AM 组可见大量的具有连续性的N F 阳性纤维(红色)(图5A )㊂S C I 组未见明显具有连续性的神经纤维(图5B )㊂S C I +S 组比S C I 组可见较多具有连续性的神经纤维(图5C )㊂S C I +S 组脊髓损伤处N F 百分比明显比S C I 组的更高,差异有统计学意义(P <0.05)(图5D )㊂㊃5302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c .2020,V o l .23N o .23图5㊀造模后2个月的N F免疫荧光染色㊀A:S HAM组N F荧光;B:S C I组N F荧光;C:S C I+S组N F荧光;D:3组脊髓损伤处的N F百分比F i g u r e5㊀N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g2m o n t h s a f t e r m o d e l i n g.A:N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o f t h e S H A M g r o u p;B:N F i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o ft h e S C I g r o u p;C:N Fi m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g o f t h eS C I+S g r o u p;D:P e r c e n t a g e o f N F a t s p i n a l c o r d i n j u r y i n t h r e e g r o u p s3㊀讨论脊髓损伤后导致临床治疗效果不佳的主要原因是局部胶质瘢痕的形成,神经传导束的离断和大量神经细胞凋亡[17-18]㊂因此,如何克服局部瘢痕障碍同时促进神经元轴突再生㊁重建神经通路是脊髓损伤治疗的关键方面㊂组织工程的发展为脊髓治疗提供了新的治疗思路,通过合成材料的介入克服神经修复的难题,并在试验探索中取得良好的效果[19-20]㊂本实验采用真空冷冻干燥的脊髓支架治疗S C I㊂这种支架结构可以诱导断裂的神经纤维再次连接并形成完整的神经传导功能,为损伤的脊髓组织提供优良的神经生长环境[21]㊂天然材料比人工合成材料具有更多的应用优势,如良好的生物相容性㊁适宜的生物降解性㊁形态重塑性强㊁人体免疫反应低㊂因此,天然材料被广泛应用于组织工程,生物医学等领域㊂但是,天然材料最明显的缺点是力学性能差,无法为组织提供足够的力学支撑㊂天然材料中,目前人类发现的最理想的用于生物组织的天然材料便是胶原㊂已有研究证实,将胶原蛋白作为支架植入损伤的脊髓内可以延长神经细胞存活时间并促进轴突生长[22]㊂组织工程学支架是否适合作为植入物植入到生物体内,其本质是考验该种支架的理化性质,其中最重要的能够促进脊髓顺利修复的性质是适宜的吸水率㊁孔隙率和降解率[23-25]㊂同时还需要有模拟脊髓硬度和弹性的力学性能[26]㊂胶原材料的多孔性为中枢神经纤维的攀爬提供桥梁,为轴突的延长和生长提供足够的物理和化学支撑;生物相容性填补脊髓空腔;低免疫原性重塑损伤后局部脊髓的微环境,减少损伤部位的胶原沉积和纤维性瘢痕形成[27]㊂然而降解速度快㊁力学性能差导致胶原无法单独使用,因此需要结合其他材料来弥补胶原材料的缺陷[28-29]㊂壳聚糖具有良好的延展性,有利于中枢神经细胞和轴突的依附,有利于刺激神经细胞的合成分泌生长因子及营养因子等优点[30]㊂聚糖是一种长而不分支的黏多糖为主体,在糖的某些部位上共价结合若干肽链而生成的复合物㊂可在一系列细胞外酶或溶酶体中细胞内酶的催化下进行降解,是药物携带的最佳载体㊂利用壳聚糖的高力学性能弥补天然材料的缺陷,将壳聚糖与胶原蛋白交联提高胶原支架机械强度[31]㊂大鼠后肢肌肉收缩强度和运动功能的恢复是组织工程应用临床治疗S C I的最终目标㊂本实验应用多种手段检测不同时间段组织工程仿生学支架对损伤后大鼠后肢功能恢复的作用㊂活体中采用运动功能评分(B B B评分)和电生理评价双后肢感觉运动及协调功能的恢复㊂离体后主要通过脊髓H E 染色评价组织工程学支架对损伤后促进神经再次生长和发育并完成神经传导及功能恢复等方面作用;本实验不仅从大体层面证明支架对脊髓修复具有积极的作用,更进一步通过微观角度进一步证明组织工程学支架的有效性,增加了本实验的说服力㊂结果显示㊃6302㊃中国实用神经疾病杂志2020年12月第23卷第23期㊀C h i n e s e J o u r n a l o f P r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sD e c.2020,V o l.23N o.23S C I+S组的治疗效果明显优于S C I组,表现在运动功能评分(B B B评分)和电生理评价明显优于S C I 组㊂与运动功能恢复相一致的是,从H E染色和N F 免疫荧光染色的结果可以得出,相比S C I组,支架治疗组从微观层面解释了改善了脊髓损伤后的病理过程,减轻水肿,减少瘢痕形成的原因,并证明了该支架可以明显促进神经再次生长和发育并完成神经传导,具有良好的临床应用前景㊂胶原-壳聚糖支架减轻组织空洞和胶质瘢痕的形成,促进脊髓神经纤维再生和运动功能的恢复㊂4㊀参考文献[1]㊀A L K A B I ES,B O I L E A U AJ.T h eR o l eo fT h e r a p e u t i cH y p o t h e r m i a A f t e r T r a u m a t i cS p i n a lC o r dI n j u r y--AS y s t e m a t i cR e v i e w[J].W o r l dN e u r o s u r g,2016,86:432-449.D O I:10.1016/j.w n e u.2015.09.079.[2]㊀N OMU R A H,T A T O R C H,S HO I C H E T M S,e ta l.B i o e n g i n e e r e d s t r a t e g i e s f o r s p i n a l c o r d r e p a i 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壳聚糖材料在脊髓损伤后神经再生的研究与作用★王磊;卢明【摘要】背景：组织工程支架材料壳聚糖能复合多种种子细胞和神经因子，维持受损组织正常的解剖结构，防止胶质瘢痕挤压，对脊髓损伤后神经再生具有重要的意义。

目的：介绍壳聚糖材料在修复脊髓损伤后神经再生领域的研究现状。

方法：由第一作者检索1990至2012年 PubMed 数据库、CNKI 数据库及万方数据库有关壳聚糖材料特性、壳聚糖导管移植治疗脊髓损伤的相关文献。

结果与结论：壳聚糖具有良好的物理、化学性能，并且具有良好的生物相容性、生物降解性，免疫抗原性小和无毒性等特殊生物医学特性，与嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞及神经干细胞具有良好的亲和性。

壳聚糖材料制备的神经导管、支架能在脊髓损伤后桥接神经断端，维持神经再生的正常解剖结构，提供种子细胞及细胞因子载体，为损伤后神经再生提供良好的微环境，但目前对于壳聚糖导管的研究仍不够全面，仍有很多问题待解决。

%BACKGROUND: Nerve conduit/scaffolds of chitosan materials can be used as the carrier of seed cells and cytokines, maintaining the normal anatomic structure and preventing glial scar extrusion in the injury site. Chitosan materials have the promoting effects on neural regeneration and functional recovery. OBJECTIVE: To introduce the research status of chitosan nerve conduit/scaffolds in neural regeneration. METHODS: The first author retrieved PubMed, CNKI and Wanfang databases (1990/2012) to search the articles related to chitosan properties and chitosan nerve conduits for spinal cord injury. RESULTS AND CONCLUSION: Chitosan has excel ent physical and chemical properties, moreover, it also has special biomedical characteristics, such asgood biocompatibility and biodegradability, low immunogenicity and non-toxicity. Chitosan has a good affinity for olfactory ensheathing cells, bone marrow mesenchymal stem cells and neural stem cells. Nerveconduit/scaffolds of chitosan materials can bridge nerve stump, maintain the normal anatomic structure fol owing neural regeneration, provide seed cells and cytokine carriers, and create a healthy micro-environment for neural regeneration after spinal cord injury. Up to now, chitosan conduit research is stil not comprehensive, and there are many problems to be solved.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】6页(P525-530)【关键词】生物材料;生物材料综述;壳聚糖;脊髓损伤;种子细胞;联合移植;神经再生【作者】王磊;卢明【作者单位】湖南师范大学第二附属医院解放军第一六三医院神经外科，湖南省长沙市400003;湖南师范大学第二附属医院解放军第一六三医院神经外科，湖南省长沙市400003【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言脊髓损伤后少突胶质凋亡和轴索髓鞘脱失是造成脊髓神经功能障碍的主要原因。

骨髓间充质干细胞复合生物支架材料修复关节软骨缺损实验研究的开题报告一、研究背景关节软骨缺损是一种常见病，尤其在运动员和老年人中较多见。

由于软骨缺乏自愈能力，缺损很容易扩大并进一步损伤关节。

传统治疗方法包括自体软骨移植和人工关节置换等方法，但治疗效果有限。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有成骨、软骨形成和自我更新等能力，因此被广泛用于关节软骨缺损的修复。

但单纯应用BMSCs存在以下问题：一是难以定位和固定在缺损部位，二是BMSCs对生长因子等刺激因素的依赖性较大，成分不稳定且活性易受影响。

复合生物支架材料是一种结构稳定的二级生物材料，能够提供生长因子等刺激因子和细胞黏附基底，促进细胞生长和分化，并可以为细胞提供载体。

此外，生物支架材料可以模拟真实环境中的生理条件，使细胞得到最佳生长环境。

因此，我们计划利用BMSCs和复合生物支架材料开发一种新的修复关节软骨缺损的方法，解决目前关节软骨缺损治疗的困难。

二、研究目的本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞复合生物支架材料修复关节软骨缺损的安全性和有效性。

三、研究方法1. 实验动物的选取和组建本实验选用SD大鼠为实验对象，用简单随机法分为实验组和对照组，每组10只。

用ISO-10993标准进行主要器官和系统损伤测定。

2. 处理方法实验组大鼠关节软骨缺损后，将BMSCs与复合生物支架材料复合后移植至软骨缺损处，对照组大鼠不进行处理。

3. 结果观察观察两组大鼠的软骨修复情况，包括软骨生长情况、软骨缺损面积缩小情况、软骨样品病理学等评价指标。

四、研究意义本研究将为关节软骨缺损的治疗提供新的治疗手段，尝试改善现有治疗方法的缺点和不足。

同时，本研究也有助于引起更多研究者对BMSCs和复合生物支架材料在临床治疗中的应用进行深入探究。

骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合修复关节软骨损伤陈路;夏先学;蒋科【摘要】背景：创伤等导致的关节软骨缺损是国内外骨科界面临的难题，组织工程学技术为软骨缺损的修复提供了新方法。

目的：探讨壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料修复兔膝关节软骨缺损的可行性。

方法：将培养的兔骨髓间充质干细胞种植到壳聚糖支架上体外构建壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料，移植到兔关节软骨缺损处为实验组，不予以特殊处理为对照组。

术后6，12周，大体观察以及甲苯胺蓝染色评定两组软骨组织修复情况。

结果与结论：术后6周，对照组仅有纤维组织增生，实验组关节软骨缺损处有软骨样组织生成。

术后12周，对照组软骨缺损边缘可观察到少量类透明软骨组织，实验组缺损区完全覆盖有光滑、透明软骨组织。

术后12周，对照组甲苯胺蓝染色较淡，有少量软骨组织生成，实验组甲苯胺蓝染色较明显，缺损完全被透明软骨组织所覆盖，软骨细胞较多。

结果表明兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架复合材料能更好的引导软骨组织的生成，促进软骨缺损修复。

%BACKGROUND:Trauma easily leads to the emergence of articular cartilage defects, which is a difficult problem in the orthopedics field. Tissue engineering technology provides a new method for cartilage repair. OBJECTIVE:To explore the feasibility of combining chitosan and bone marrow mesenchymal stem cels to repair injured articular cartilage in rabbits. METHODS: Cultured rabbit bone marrow mesenchymal stem cels were seeded onto chitosan scaffold, and then the composite material was implanted into the defect as experimental group. Rabbits with no treatment served as control group. Gross observation and toluidine blue staining were carried out at 6 and 12 weeks after operation. RESULTS ANDCONCLUSION:At 6 weeks after operation, the control group had only fibrous tissue hyperplasia, and in the experimental group, cartilage-like tissues were generated at the defect site. At 12 weeks after operation, a smal amount of hyaline cartilage-like tissues were observed in the control group, and the defects in the experimental group were covered with smooth and hyaline cartilage tissues. After 12 weeks, the toluidine blue staining was light in the control group with a smal amount of cartilage tissues; in the experimental group, the toluidine blue staining was remarkable, and the defects were completely covered with hyaline cartilage tissues, and cartilage cels were increased in number. The findings indicate that chitosan-bone marrow mesenchymal stem cels composite material is better to induce cartilage tissue formation and promote cartilage defect repair.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)045【总页数】5页(P7254-7258)【关键词】干细胞;骨髓干细胞;软骨缺损;关节软骨;软骨修复;组织工程学;壳聚糖;细胞支架;骨髓间充质干细胞;动物模型【作者】陈路;夏先学;蒋科【作者单位】川北医学院附属医院骨科，四川省南充市 637000;川北医学院附属医院骨科，四川省南充市 637000;川北医学院附属医院骨科，四川省南充市637000【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1关节软骨缺损是一种常见的病变类型，临床治疗可选择不同的方法，但大多无法获得理想的效果。

壳聚糖基复合支架对大鼠大脑皮层损伤修复的研究的开题报告一、研究背景和意义大脑皮层损伤是一种严重的神经系统疾病，具有高发性、致残性、复发性等特点，给患者带来严重的生活质量降低和经济负担。

目前，大脑皮层损伤的治疗方法主要包括手术治疗和药物治疗等，但这些方法在临床上存在一定的局限性和不足。

因此，寻求一种有效的治疗方法对大脑皮层损伤患者具有重要的临床意义。

壳聚糖作为一种天然产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在医学领域有着广泛的应用。

同时，壳聚糖可以与其他物质形成复合物，增强其功能，例如用于支架等。

因此，将壳聚糖与其他材料组成复合支架，能够为大脑皮层损伤的修复提供新的思路和方法。

二、研究内容和方案本研究将以大鼠为研究对象，采用局部大脑皮层损伤模型，通过壳聚糖基复合支架对大鼠大脑皮层损伤进行修复。

具体方案如下：1.实验动物的选取和分组选用50只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重220-250g。

将大鼠按随机数字表法分为5组，每组10只。

2.实验材料和器械的制备和准备（1）壳聚糖：采用天然壳聚糖。

（2）支架材料：采用聚丙烯支架，内植入壳聚糖。

（3）手术器械：手术刀、显微镜、吸管、缝合线等。

3.实验操作和技术方法（1）建立局部大脑皮层损伤模型：采用手术刀在大鼠大脑皮层上切割制作出局部大脑皮层损伤模型。

（2）制备壳聚糖基复合支架：采用自组装法制备壳聚糖基复合支架。

将壳聚糖加入适量的水中制成溶液，与聚丙烯支架进行混合，使壳聚糖和支架充分结合。

（3）复合支架的植入：将壳聚糖基复合支架植入到大鼠损伤区域。

（4）实验数据的采集和记录：观察大鼠的行为、状态、病情等变化情况，对实验结果进行记录和统计分析。

4.实验的预期结果预期结果为，使用壳聚糖基复合支架对大鼠大脑皮层损伤进行修复，可以促进神经元的生长和再生，增加损伤部位的细胞活力，修复大脑皮层结构和功能。

同时，壳聚糖基复合支架具有生物可降解性，可在一定时间内缓慢分解，不会产生有害物质，具有广阔的应用前景。

・综 述・组织工程支架修复脊髓损伤的研究进展蒋　涛综述　任先军审校作者单位:第三军医大学附属新桥医院骨科重庆400037电话:(023)68774908　E 2mail:fr omcq2000@sina .com 脊髓损伤(Sp inal Cord I njury,SC I )是骨科领域致残率、死亡率最高的创伤之一,人们不断努力探索神经元轴突再生机制,试图找到有效的治疗方法。

目前,治疗S C I 的主要策略有:挽救受损神经元,减少其发生迟发性损伤和凋亡;应用刺激神经生长的因子和/或阻断抑制轴突生长和延伸物质的作用,促进受损轴突的再生;组织或细胞(外周神经、胚胎脊髓、神经干细胞、神经胶质细胞等)移植诱导轴突再生和细胞分化。

他们对修复SC I 起到了很大作用,但尚无根本突破。

近年来,运用组织工程支架修复SC I 的新思路已日益受到人们重视。

1　SC I 研究的现状作为中枢神经系统,脊髓是一个由大量神经元和神经纤维精确连接构成的三维立体网络系统,具有复杂的结构。

SC I 会直接导致神经元坏死、神经纤维中断,继而引发包括炎症反应、缺血损伤、各种毒性物质大量释放、神经元凋亡等一系列复杂的病理生理学变化,脊髓结构严重破坏。

而SC I 区轴突再生却又存在诸多困难,如:髓鞘抑制蛋白、胶质瘢痕等神经再生抑制因素的存在,多种神经营养因子缺乏等。

此外,SC I 修复不同于其它组织,要求极高,必须重建轴突与靶细胞间的精确连接才有根本意义。

种种复杂因素为修复SC I 的研究带来了巨大挑战。

当前SC I 的各种治疗策略均不能达到理想效果。

其中存在的问题有:神经元凋亡机制尚未完全弄清,外源性应用神经营养因子难以持续恒定起效,而细胞移植在移植部位缺少支持基质,其作用难以充分发挥,此外,如何抑制胶质瘢痕的生成也是难以突破的瓶颈。

SC I 治疗研究需要另寻出路。

2　修复SC I 组织工程学理念近年来,许多学者已经意识到单一依靠某种细胞或神经营养因子不可能彻底解决SC I 治疗中所遇到的问题。

超声反映壳聚糖神经导管修复缺损坐骨神经的效果目前观察神经导管在体内的降解变化需要处死动物才能观察到，这需要过多的实验动物。

超声是一种临床常用的无创检测方法，已在许多领域应用，但还未见超声观察植入体内的神经导管。

中国南通大学附属医院王鸿奎所在研究团队，首次使用超声观察植入大鼠体内的壳聚糖神经导管随时间的变化，发现其可以客观地显示壳聚糖神经导管桥接大鼠坐骨神经缺损后，有无塌陷、断裂和血肿等不良反应，以及随植入时间延长管壁的降解、吸收趋势。

证实超声检测可作为传统有创手段的有效补充，可以准确和客观地监测、评估壳聚糖神经导管植入体内后的变化情况。

相关文献发表于《中国神经再生研究（英文版）》杂志2014年7月第14期。

造模3周后，超声检测可见大鼠坐骨神经缺损部位中清晰的壳聚糖神经导管Article: " Ultrasound imaging of chitosan nerve conduits that bridge sciatic nerve defects in rats," by Xiaoyang Chen2, Yifei Yin2, Tingting Zhang2, Yahong Zhao3, Yumin Yang3, Xiaomei Yu2, Hongkui Wang1, 3 (1 School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province, China; 2 Department of Doppler Ultrasound, Afliated Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China; 3 Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China)Chen XY, Yin YF, Zhang TT, Zhao YH, Yang YM, Yu XM, Wang HK. Ultrasound imaging of chitosan nerve conduits that bridge sciatic nerve defects in rats. Neural Regen Res. 2014;9(14):1386-1388.欲获更多资讯：Neural Regen ResUltrasound imaging of chitosan nerve conduits that bridge sciatic nerve defects in ratsNew simple and effective methods are needed to better evaluate the outcomes of repair using nerve conduits in vivo. Ultrasound is a common noninvasive clinical detection modality that has been used in many fields. However, ultrasound has only rarely been used to observe implanted nerve conduits in vivo. Hongkui Wang and co-workers from Affiliated Hospital of Nantong University report the first use of ultrasound to noninvasively observe the changes in chitosan nerve conduits implanted in rats over time. The ultrasound imaging clearly showed whether there are unsatisfactory complications after implantation, such as fracture, collapse, bleeding, or unusual swelling of the nerve conduits; and reflected the degradationmode of the nerve conduit in vivo over time. Ultrasound, as a noninvasive imaging modality, can be used as a supplementary observation method during conventional animal experiments on peripheral nerve tissue engineering. The relevant study has been published in the Neural Regeneration Research (Vol. 9, No. 14, 2014).Ultrasound imaging of the morphology of a chitosan nerve conduit in a rat model of sciatic nerve defects at 3 weeks after modeling.Article: " Ultrasound imaging of chitosan nerve conduits that bridge sciatic nerve defects in rats," by Xiaoyang Chen2, Yifei Yin2, Tingting Zhang2, Yahong Zhao3, Yumin Yang3, Xiaomei Yu2, Hongkui Wang1, 3 (1 School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province, China; 2 Department of Doppler Ultrasound, Afliated Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China; 3 Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong, Jiangsu Province, China)Chen XY, Yin YF, Zhang TT, Zhao YH, Yang YM, Yu XM, Wang HK. Ultrasound imaging of chitosan nerve conduits that bridge sciatic nerve defects in rats. Neural Regen Res. 2014;9(14):1386-1388.。