DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告

DNA定量测定(二苯胺法)实验报告
实验目的：利用二苯胺法对DNA进行定量测定，获得DNA
的浓度信息。

实验原理：二苯胺法是一种常用的DNA定量测定方法。

其原
理是DNA与二苯胺反应生成发色产物，并在560 nm波长下
具有最大吸收量，通过测定吸光度来计算DNA的浓度。

在实
验中，先将待测的DNA样品与二苯胺溶液反应得到发色产物，然后通过比较其吸光度与已知浓度标准曲线的关系来计算待测样品的DNA浓度。

实验步骤：
1. 准备工作：将工作区域消毒，摆放实验所需仪器器材。

2. 制备标准曲线：依次稀释5 μg/mL的DNA溶液，得到一系
列不同浓度的DNA标准溶液。

将标准溶液与相同体积的二苯
胺溶液混合，反应10分钟。

然后在560 nm波长下测定溶液的吸光度，并绘制标准曲线。

3. 处理待测样品：将待测样品与相同体积的二苯胺溶液混合，反应10分钟。

然后在560 nm波长下测定溶液的吸光度。

4. 计算DNA浓度：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代
入计算公式，得到DNA的浓度。

实验结果：
标准曲线数据：（以吸光度为横坐标，DNA浓度为纵坐标）
吸光度（A） DNA浓度（μg/mL）
0.1 1
0.2 2
0.3 3
0.4 4
0.5 5
待测样品数据：
吸光度（A） = 0.25
根据标准曲线计算得到的DNA浓度为2.5 μg/mL
实验结论：根据二苯胺法对DNA的定量测定结果，待测样品的DNA浓度为2.5 μg/mL。

DNA的定量测定-二苯胺法一、实验目的1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法；2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

二、实验原理1．DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。

2．在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。

三、实验仪器试管移液管7220分光光度计四、实验试剂1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。

2、二苯胺试剂：A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。

贮于棕色瓶中。

B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可五、实验验步骤1.标准曲线的绘制加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。

2.样品测定吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。

然后加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。

根据实验数据制得标准曲线如下：由上表可知样液的吸光度y=0.115，则由标准曲线得出DNA样液的浓度x=18.49μg/ml。

故样品中DNA的质量=18.49×6÷1.0=110.94μg七、实验分析1. 测定DNA含量的方法还有哪些原理?荧光法，用Pico Green荧光染料，测定DNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。

2. 实验中加入乙醛的目的?甲醛引起DNA的断裂损伤,DNA在酸性条件下加热，在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度.。

猪肝基因组DNA的分离纯化及鉴定摘要利用十二烷基硫酸钠（SDS）裂解猪肝组织细胞，用氯仿、异戊醇抽提蛋白质以分离核酸，然后用盐溶法分离出DNA，用冷乙醇沉淀，最后分别用紫外分光光度法和二苯胺显色法测定DNA纯度，并比较二者的结果。

关键词：DNA纯化鉴定紫外分光光度法二苯胺Separation,purification and identification of genomic DNA inpork liver cellsAbstract:In our experiment the lysis of pork liver cells is accomplished with sodium dodecyl sulfate(SDS).And the protein is separated with chloroform and isoamyl alcohol and the nucleic acid is obtained.Then DNA is separated by concentration of NaCl.Finally the ultraviolet spectrophotometry is used to determine the purity.Key words:DNA;Purification;Determination;ultraviolet spectrophotomentry;Diphenylamine核酸研究的首要方法是分离和测定。

核酸制备中需要注意的共同问题是防止核酸的降解和变性，要尽量保持其在生物体内的天然状态。

故必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。

天然核酸都具有生物活性，这是检验其质量的重要指标。

物理化学指标也常用来评定核酸的品质，这些指标包括：相对分子质量，紫外吸收，沉降系数，电泳迁移率，粘度等。

制备方法的不同因材料的不同而有很大差异1。

动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸DNA,为英文Deoxyribonucleic acid的缩写,又称去氧核糖核酸,是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,同时也是组成基因的材料;有时也被称为“遗传微粒”,原因是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中,从而完成性状的传播;DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色;DNA对紫外线260nm有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定;当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应；当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平;较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋;在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体则统称为染色体组;对于人类而言,正常的体细中含有46条染色体;染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA 合成后期;对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物,如细菌而言,则主要存在于细胞质中的拟核内;染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录;脱氧核糖核酸的结构DNA的结构： DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平;DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸dAMP脱氧腺苷、胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTMP 脱氧胸苷、胞嘧啶脱氧核苷酸dCMP 脱氧胞苷、鸟嘌呤脱氧核苷酸dGMP 脱氧鸟苷;而脱氧核糖五碳糖与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧;每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成;读取密码的过程称为转录,是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA信使RNA的核酸分子;DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’, 5’-磷酸二酯键相连构成的长链;大多数DNA含有两条这样的长链,也有的DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等;DNA有环形DNA和链状DNA之分;在某些类型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富;在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶;40年代后期,查加夫发现不同物种DNA的碱基组成不同,但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数A=T,鸟嘌呤数等于胞嘧啶数G=C,因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和,一般用几个层次描绘DNA的结构;浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到;人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个;肝细胞为多角形,直径约为20-30/加微米,有6-8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大;每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种;肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成;二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;四、实验器材和材料试剂实验器材：①匀浆器②量筒③离心机④离心管⑤试管⑥吸管⑦恒温水浴锅实验材料：①猪肝实验试剂：①L L 柠檬酸钠溶液②95%乙醇.③NaCl固体.④5%SDS溶液5g SDS 定容至100ml⑤V氯仿：V异戊醇20：1的混合液五、实验操作1.称量①称取一定质量的猪肝,加入2倍肝重的L L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎已完成;2.提取DNA①量取肝糜4 ml 于10毫升离心管,在4000r/min下离心10min ,沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min；②弃上清,取沉淀；③将沉淀用10 ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS,振荡30min保鲜膜封口；④缓慢加入固体NaCl约,使其最终浓度为1mol/L；⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中,在4000r/min离心5 min,取上清水相；⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇,边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品；⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中;3.标准曲线的绘制按下表加入各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,在595nm波长下于分光光度计比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制作标准曲线;4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA样液,加入蒸馏水,混匀;然后准确加入二苯胺试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,595nm波长下于分光光度计比色测定,根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量ug;5.计算100g猪肝中DNA含量w=m1/m2×100%w：DNA的质量分数%m1：样液中测得的DNA的质量ugm2：样液中所含样品的质量ug六、实验数据处理1.标准曲线2.实验结果处理猪肝质量为DNA提取液体积为根据公式w=m1/m2×100%得：w=％则100g猪肝中DNA含量为：w×100=七、思考题1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用答：①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂,也是pH缓冲溶液；②SDS是表面活性剂,可以让蛋白质与DNA分开；③氯仿是有机溶剂,可以使蛋白质聚集沉淀,便于分离出去；④异戊醇是消泡剂,可以减少泡沫的发生；⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液,在这样的环境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白则溶解度很低,可以利用这一性质分离两种核酸;八、实验注意事项主要集中在细胞核中,因此,通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料,小牛胸腺组织中细胞核比例较大,因而DNA含量丰富,同时其脱氧核苷酸酶活性较低,制备过程中DNA被降解的可能性相对较低,所以是制备DNA的良好材料,但其来源较困难,脾脏或肝脏易获得,也是实验室制备DNA常用的材料,本实验用新鲜肝脏作为实验材料;2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解,须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行,可加入某些物质抑制核酸酶的活性,如柠檬酸钠、EDTA、SDS等,EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂;3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多,经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等,他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚,并释放出核酸;4.使用离心机时,对称放置的离心管必须用天平调平衡;5.避免剧烈振荡,如研磨过程、搅拌过程等;九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析,得出100g猪肝中DNA含量大约为的结论,在上网查阅相关资料后发现：猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合;由此可知,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;但是本次实验结果只是粗略测量,并未达到精确测量猪肝中DNA的含量,且实验数据较理论值偏低,这是由于某些误差导致,在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差,经分析得出以下几点：①在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中,由于猪肝组织表面较滑不易磨碎,且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留,因此可能导致猪肝中DNA 提取不充分,致使实验数据较理论值偏低；②研磨过程中,可能由于操作不当,导致部分液体溅出,因此可能使得提取液中部分DNA损失,导致实验数据偏低；③在粗提取DNA操作中,频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内,可能有极小部分DNA提取液未倒净,残留在仪器壁上损耗掉,导致实验误差；④在使用移液枪的过程中,可能因为操作不当或移液枪经常错误使用,出现仪器误差,导致吸取的DNA样液不精确,出现实验误差；⑤在水相中加入乙醇析出DNA时,不是所有DNA均析出,有小部分依旧融在溶液,导致提取出的DNA含量偏低；⑥标准曲线制作过程中出现些许误差；总的来讲,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性,严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行,保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低,尽可能达到预期的实验效果,完成自我的学习及锻炼过程;。

动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。

有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。

DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。

DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。

当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。

较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA 的解螺旋。

在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。

对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。

染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。

对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。

染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。

脱氧核糖核酸的结构DNA的结构： DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。

DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。

而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。

每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。

动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。

有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。

DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。

DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。

当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。

较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。

对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。

染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。

对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。

染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。

脱氧核糖核酸的结构DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。

DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。

而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。

每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。