基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。

⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。

TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。

基因敲除斑马鱼构建方法!一、基因敲除的设计方案1.1 基因的基本信息确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI 等查询。

1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析1.3分析蛋白质的保守结构功能域通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。

1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。

二、CRISPR活性验证2.1 分析并确认基因组序列设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。

该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。

2.2 合成sgRNA使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3 显微注射将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。

2.4 活性验证随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

•如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；•如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）三、突变体制备及确认3.1 F0饲养如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遗传突变的确认将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。

以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。

3.3 F1饲养将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。

3.4 F1确认将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。

《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。

在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。

三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。

含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。

转基因斑马鱼构建技术
斑马鱼是一种近年来发展非常迅速的模式动物，在生物医学研究领域有越来越多的应用。

斑马鱼和人类的基因同源性85%以上，疾病信号转导通路高度保守，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，利用高效的ToI2转座酶系统可构建转基因斑马鱼。

斑马鱼作为模式动物，还具有以下的优点：
1、与人类同属于脊椎动物
2、个体较小，因此养殖需要的场地空间较小
3、繁殖力强，可进行高通量筛选
4、体外受精，便于繁育
5、药物用量小
6、早期透明，早期发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后七天内部器官清晰可见，可以活体进行荧光观察斑马鱼可以用于研究基因表达调控、基因功能域发育、分化、形态发生的关系，也可以用于研究发病机理，也可以用于药物筛选。

[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。

关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。

试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。

分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。

(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。

当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。

(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。

(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。

过表达Baff转基因斑马鱼的构建张力;谢英;刘树锋【摘要】Objective To construct pEGFP-Cl-baff, pEGFP-N1 -baff, and pIRES2-EGFP-baff recombinant plasmids, and establish a SLE disease model of Baff overexpressed zebrafish by microinjection and fluorescence screening . The aim is to evaluate the meaning of Baff over expression zebrafish in study of SLE mechanism and drug selection . Methods We cloned baff full length cDNA encoded by 807 bp nuclear acid using spleens RNA of zebrafish by RT-PCR and constructed 3 types of baff overexpression plasmids : pEGFP-Cl -baff, pEGFP-N1-baff- and pIRES2-EGFP-baff. Baff protein expression was estimated by in -vitro cell transfection and Western blotting. Results 3 types of baff overexpression plasmids were examined by agarose gel electrophoresis . Western blotting and in-vitro transfection confirmed the expression of Baff-GFP fusion protein. We also obtained the baff over expression zebrafish by microinjection and fluorescence screening. Conclusion All the plasmid we constructed in our research have been estimated and could be used to generate the disease model of baff overexpression zebrafish which can be manipulated for immune -disease research.%目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义.方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff 及 pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼.结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼.结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】5页(P46-49,后插4)【关键词】系统性红斑狼疮;B细胞活化因子;斑马鱼;转基因【作者】张力;谢英;刘树锋【作者单位】河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R332斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一［1，2］。

转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

嵌合体动物（chimera mosaic animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。

这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。

转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。

转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。

鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000 种。

这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。

有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。

有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。

尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。

因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。

核酸酶I-SceI介导的转基因斑马鱼构建及连接蛋白Connexin48.5的定位研究刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【摘要】细胞连接蛋白是由多基因家族编码的一类结构相似、分子质量不同的蛋白质.在细胞膜上,每6个相同或不同的连接蛋白围绕中央孔排列形成一个连接子,相邻细胞膜上的连接子相互对接形成细胞间隙连接,细胞间隙连接是一种重要的通讯连接,它不仅是细胞间代谢偶联、冲动传导的结构基础,而且可以通过介导与细胞的迁移、分化、增生和器官形成有关的信号物质而在胚胎发育中起重要作用.为了进一步探讨细胞间隙连接在生物体中的作用,采用斑马鱼胚胎显微注射核酸酶I-SceI 和质粒DNA的方法成功构建了绿色荧光蛋白GFP与细胞连接蛋白Connexin48.5融合表达的转基因荧光斑马鱼品系,并通过对荧光蛋白发光的观察在斑马鱼鱼体中进行连接蛋白Connexin48.5的定位.实验结果表明:核酸酶I-SceI介导下的斑马鱼转基因方法效率较高,可行性好;连接蛋白Connexin48.5在斑马鱼体内主要定位于眼球晶状体和脊索.所获得的Connexin48.5-GFP融合表达斑马鱼系,以及利用该品系进行的Connexin48.5定位研究对细胞连接蛋白在生物体内的功能研究将具有重要作用.%Connexinj are a group of proteins coded by multi gene family. On the cell membrane,every 6 Connexins combine together to form a Connexon,and two Connexons of two different cells connect with each other to form a gap junction. Gap junction is a very important kind of communicational connection between cells,which is not only the constructional basic of metabolic coupling and signal transduction betweens cells,but also the channel of signal substance controlling cell migration,differentiation,proliferation and or-ganogenesis. For a deeperstudy of gap junction function in organisms, we generated a transgenic zebrafish line that expresses Con-nexin48. 5-GFP fusion protein by co-injecting meganuclease I-Scel and plasmid DNA into zebrafish embryos. I-Scel mediated trans-genesis showed high efficiency,which made it a better way to get transgenic animals than the traditional method. While the working mechanism of I-Scel remains unclear, in our opinion, I-Seel binds to its recognition site after the cleavage and promotes nuclear localization of the transgene could be a good explanation. Using our transgenic zebrafish line, we found that Connexin48. 5 is highly expressed in lens and notochord in zebrafish. In addition to its expression in lens,which has been reported preciously,our new finding suggested that Connexin48. 5 could have important roles in notochord development or nervous system function【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】4页(P1066-1069)【关键词】I-SceI;Connexin48.5;转基因;晶状体;脊索【作者】刘俊;杨镇滔;李汉杰;田书也;韩家淮【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q356.1斑马鱼属鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Brachydanio），原产于南亚，是一种常见的热带鱼，具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因突变与筛选.这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一.由于斑马鱼具有胚胎透明这一突出优点，绿色荧光便于观察，我们选取其作为构建Connexin48.5－GFP融合表达品系的实验动物，从而进行细胞连接蛋白Connexin48.5的定位以及功能研究.细胞连接蛋白是构成间隙连接的基本单位，6个连接蛋白聚合成一个中间有孔道的连接子，两个连接子对接形成一个间隙连接.目前在哺乳动物中发现的连接蛋白至少有20种，分子质量从26～50ku不等，依分子质量的不同而分别命名为Connexin32、Connexin48.5、Connexin26、Connexin43、Connexin36等［1－2］.细胞间隙连接是在相互接触的细胞之间建立的有孔道的、由连接蛋白构成的亲水性跨膜通道，允许无机离子、第二信使及水溶性小分子质量的代谢物质从中通过，从而沟通细胞达到代谢与功能的统一，在细胞生长、细胞增殖与分化、组织稳态、肿瘤发生、伤口愈合等生理和病理过程中具有重要作用.我们的工作有助于进一步研究连接蛋白以及间隙连接在这些过程中的具体功能.1 材料与方法1.1 材料实验所用的pBSKI2转基因质粒，大肠杆菌DH5α，野生型斑马鱼由本实验保存；分子克隆所需试剂，Taq酶，核酸外切酶ExoⅢ，限制性内切酶，核酸酶I－SceI 等均购自 Takara公司；Tris－HCl、EDTA、氯化钠、十二烷基磺酸纳（SDS）、酚－三氯甲烷、蛋白酶K等购于上海生工生物工程有限公司.斑马鱼饲养：所用斑马鱼均饲养于厦门大学生命科学院斑马鱼室循环水系统中，温度：24～30℃，光照周期：14h（光照）∶10h（黑暗），每天3次定时投喂丰年虫.1.2 方法1.2.1 利用 LIC（ligase independent cloning）的高效克隆方法构建pBSKI2转基因质粒从斑马鱼基因组中采用PCR的方法分段扩增并回收目的片段，包括连接蛋白基因的表达调控区域及蛋白编码区域.用BamHⅠ和HindⅢ对质粒pBSKI2进行双酶切并回收.在冰上混合载体和片段，加入1μL ExoIII，吹吸混匀，反应1h，然后加入1μL 0.5 mol／L EDTA（pH 8.0），吹吸混匀，终止反应.将反应体系放入60℃水浴锅5min，然后冰浴5min.之后转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min后42℃热激45s，冰上放置5min.涂板，37℃恒温培养箱中培养16h后挑取单克隆，扩增后进行质粒提取并鉴定，获得目的克隆.1.2.2 核酸酶I－SceI介导的高效率转基因斑马鱼构建1）斑马鱼胚胎获取：在繁殖的前一天，光周期的暗周期前用隔板将繁殖的亲鱼分开，并在水箱底部铺上隔离网以防止亲鱼产卵后吞卵.次日清晨，将水族箱中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄鱼开始追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，这时雌鱼产卵，雄鱼排精，受精卵落入隔离网下.在卵产下0.5h内，捞出亲鱼，收集受精卵，用培养液清洗数次，待用.2）斑马鱼胚胎显微注射：优化注射条件，尝试质粒DNA浓度梯度和重组酶浓度梯度，确定目的基因整合效率最高时的注射条件（表1）［3－4］.表1 显微注射体系Tab.1 The microinjection cocktail?将获取待用的斑马鱼胚胎在琼脂固定槽中摆放整齐，在胚胎发育的单细胞期（约受精后40min内），将适量注射液注入胚胎细胞中（确保注入细胞中，而不是卵黄中），注射体积不超过胚胎总体积的1／10，注射完成后，将胚胎置于斑马鱼胚胎培养液中，28℃培养.每晚挑出弃去死去的胚胎并换液，注射后第2天晚上，在倒置荧光显微镜下观察，挑出发荧光的胚胎置于另一培养皿中培养；注射后第4天，将小鱼移入斑马鱼幼鱼培养箱中饲养.2 实验结果2.1 GFP与Connexin48.5融合表达的转基因斑马鱼品系的构建共构建了4个不同亚型的连接蛋白与GFP的融合表达质粒（pBSKI2－Connexin48.5－GFP、pBSKI2－Connexin39.9－GFP、 pBSKI2－Connexin28.6－GFP、pBSKI2－Connexin43－GFP），经斑马鱼胚胎显微注射后，注射质粒pBSKI2－Connexin48.5－GFP 的胚胎可观察到较强的荧光（图1），其余3个质粒未见发光.挑选出注射后发荧光的胚胎后，通过饲养、杂交、自交等过程，获得了纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系.图1 pBSKI2－Connexin48.5－GFP 注射结果（60×）Fig.1Microinjection results of pBSKI2－Connexin48.5－GFP（60×）2.2 Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中的表达鉴定在获得纯合的Connexin48.5－GFP融合表达的转基因斑马鱼品系后，为了确定Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，进行了共聚焦拍照，结果显示Connexin48.5在斑马鱼眼球晶状体和脊索中高表达（图2，红色箭头所指区域），在晶状体中的高表达与已有的研究结果相同［5－7］，而其在脊索中的高表达是我们的一个新发现.由于已知细胞连接蛋白表达于细胞间的连接处，为了验证获得的融合表达品系的Connexin48.5表达情况是否正常，对大量表达于细胞间隙的连环蛋白β（β－catenin）进行了免疫荧光染色（红光）从而确定细胞膜的位置，与Connexin48.5－GFP放出的绿光对比后发现存在共定位（图3），这表明获得的转基因品系的Connexin48.5的细胞内表达定位情况正常，与GFP的融合表达不影响其正常功能.3 讨论通过核酸酶I－SceI介导下的转基因方法，成功构建了Connexin48.5与GFP融合表达的转基因斑马鱼品系（Connexin48.5－GFP）.利用该品系斑马鱼，通过对绿色荧光蛋白发光的观察确定了Connexin48.5在斑马鱼全鱼中的定位，该结果在验证了已有的研究成果的同时还做出了新的发现.作为工具，该品系斑马鱼在将来Connexin48.5的功能研究中将具有重要价值.相对于直接注射线性DNA的传统转基因方法，所采用的I－SceI介导下的转基因方法具有更高的阳性率.不过对于I－SceI提高转基因效率的分子机制目前尚无研究定论，认为一个可能的解释是由于I－SceI在对质粒进行酶切后仍会继续在识别位点与DNA相互结合，这种结合可能会提高目的DNA向核内的转运效率，从而提高目的片段插入基因组的效率.过去已有的研究显示Connexin48.5在mRNA水平于斑马鱼晶状体中高表达，且有证据表明其在晶状体发育中至关重要［3－4］，我们的实验结果在蛋白水平验证了Connexin48.5在晶状体中的高表达，这对研究其在晶状体发育中的具体功能具有重要指导作用.在此基础上，还发现Connexin48.5在斑马鱼脊索中也存在高表达，这一新发现表明Connexin48.5可能在斑马鱼的脊索发育中或神经系统功能中具有重要作用，这为将来Connexin48.5的功能研究指出了新的方向.【相关文献】［1］Kibschull M，Gellhaus A，Winterhager E.Analogous and unique functions of connexins in mouse and human placental development［J］.Placenta，2008，29（10）：848－854.［2］Yeager M，Harris A L.Gap junction channel structure in the early 21st century：facts and fantasies［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19（5）：521－528.［3］Violette T，Clemens G，Filomena R，et al.I－SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish ［J］.Mechanisms of Development，2002，118（1／2）：91－98.［4］Minjung K，Kyung K，Cheol K，et al.Real－time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP［J］.Biotechniques，2008，45（3）：331－334.［5］Charles K，William B，Seth K，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish［J］.Developmental Dynamics，1995，203（1）：253－310.［6］Shaohong C，Tara C，Gunnar V.Expression of Connexin48.5，Connexin44.1，and Connexin43during zebrafish（Danio rerio）lens development［J］.Developmental Dynamics，2003，228（4）：709－715.［7］Shaohong C，Teresa S，Rickie M，et al.Connexin48.5is required for normal cardiovascular function and lens development in zebrafish embryos［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（35）：36993－37003.。