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第1篇一、实验目的1. 理解基因工程转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握基因工程转化实验的操作步骤和技巧。
3. 通过实验，验证基因转化效果，为后续研究提供基础数据。
二、实验原理基因工程转化实验是将目的基因导入受体细胞的过程。
根据受体细胞的不同，转化方法也有所区别。
本实验采用农杆菌介导转化法，将目的基因导入植物细胞。
三、实验材料1. 受体植物：小麦植株2. 转化质粒：含目的基因的质粒3. 农杆菌：具有转化能力的农杆菌菌株4. 实验试剂：氯化钙、CaCl2溶液、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗菌素等5. 实验仪器：超净工作台、无菌操作箱、移液器、离心机、培养箱、显微镜等四、实验步骤1. 农杆菌活化与扩大培养（1）将冻存的农杆菌菌株复苏，在含有抗菌素的LB培养基中扩大培养。
（2）将培养好的农杆菌转移到无菌条件下，用移液器吸取适量菌液，加入含有转化质粒的LB培养基中。
（3）将菌液在摇床上振荡培养过夜。
2. 农杆菌转化（1）将小麦叶片进行表面消毒，用无菌移液器吸取适量菌液，滴在叶片表面。
（2）将叶片放入无菌培养皿中，在黑暗条件下共培养3-5天。
3. 农杆菌侵染与再生（1）将共培养后的叶片转移到含有抗菌素的培养基上，进行再生培养。
（2）待再生植株长出后，进行筛选，去除未转化植株。
4. 转化植株PCR检测（1）提取转化植株的总DNA。
（2）设计目的基因的引物，进行PCR扩增。
（3）观察PCR产物，判断转化效果。
五、实验结果与分析1. 农杆菌活化与扩大培养实验中，农杆菌菌株在LB培养基中生长良好，菌液呈均匀浑浊状。
2. 农杆菌转化共培养后，小麦叶片出现明显的不定芽，表明农杆菌已成功侵染植物细胞。
3. 农杆菌侵染与再生再生培养过程中，部分植株长出不定芽，表明农杆菌已成功转化植物细胞。
4. 转化植株PCR检测PCR检测结果显示，部分转化植株扩增出目的基因片段，表明基因转化成功。
六、实验结论本实验采用农杆菌介导转化法，成功将目的基因导入小麦植株。
基因工程实验报告一、实验目的：本实验旨在掌握基因工程的基本操作技能，了解DNA的提取、PCR扩增和基因克隆等基本实验过程，并通过实际操作检测转基因植物的存在。
二、实验原理：1.DNA提取：采用传统的CTAB法提取植物基因组DNA，目的是获得待测植物样品中的基因组DNA。
2.PCR扩增：选用合适的引物，利用PCR技术将待测基因扩增出来。
PCR反应中需要设置阳性对照、阴性对照和试验样品，以确定PCR扩增结果的可靠性。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因与质粒载体进行连接，再将重组质粒导入大肠杆菌进行转化培养，最后通过酶切和测序等方法验证目标基因的克隆成功与否。
三、实验步骤：1.DNA提取：将待测植物样品加入CTAB提取缓冲液中，酶解并脱脂植物细胞，通过乙酰酚/氯仿法提取总DNA。
2. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR反应。
反应条件通常为94℃预变性5min，然后循环20-35次，每次循环包括94℃变性30s、56-68℃退火30s、72℃延伸1-2min，最后72℃延伸10min。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因进行酶切，并与质粒载体进行连接，然后转化大肠杆菌进行培养。
通过PCR重放大和酶切验证目标基因是否成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序等方法对目标基因进行验证，判断基因克隆是否成功。
四、实验结果与分析：1.DNA提取：从待测植物样品中成功提取到总DNA，并进行酶切分析，可见DNA带状条带。
2.PCR扩增：通过PCR扩增，得到了目标基因的特异性条带，并且也验证了阳性对照和阴性对照的准确性。
3.基因克隆：通过酶切和重放大等方法验证了目标基因的成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序结果，确认目标基因与已知序列一致，说明基因克隆成功。
五、实验结论：通过本实验，我们掌握了基因工程的基本操作技能，成功进行了DNA提取、PCR扩增和基因克隆等实验过程，并通过测序等方法验证了目标基因的克隆成功。
生态足迹姓名：程庆佳专业：生物技术学号：20091070004序号：10生态足迹（简称EF），或称生态空间占用，最早是由加拿大生态经济学家William Rees 等在1992年提出并在1996年有其博士生Wackernagel 完善的一种衡量人类对自然资源利用程度以及自然界为人类提供的生命支持服务功能的方法。
该方法通过估算维持人类的自然资源消费量和同化人类产生的废弃物所需要的生态生产性空间面积大小，并与给定人口区域的生态承载力进行比较，来衡量区域的可持续发展状况。
关于生态足迹的概念，WilliamE.R曾将其形象地比喻为“一只负载着人类与人类所创造的城市、工厂⋯⋯的巨脚踏在地球上留下的脚印”。
生态足迹的计算主要基于以下两个事实：（1）人类能够估计自身消费的大多数资源、能源及其所产生的废弃物数量；（2）这些资源和废弃物流能折算成生产和消纳这些资源和废弃物流的生态生产性面积。
因此，任何特定人口（从单一个人到一个城市甚至一个国家的人口）的生态足迹，就是其占用的用于生产所消费的资源与服务以及利用现有技术同化其所产生的废弃物的生物生产土地或海洋的总面积。
生态足迹通过对一定的经济水平或人口对生产性资源需求的测定形象地反映人类对地球的影响；同时，它把自然资产的需求与支持人类生活的生物世界联系起来进行对比，则包含了可持续性的机制内涵。
这就是说，当地球所能够提供的土地面积容不下这只“巨脚”时，其上的城市、工厂就会失去平衡；如果“巨脚”始终得不到一块允许其发展的立足之地，那么它所承载的人类文明将最终坠落、崩毁。
该定义的提出为我们形象地提供了更接近于真实的人类对自然界和生态系统的依赖程度。
与以往对生态目标测度的“承载力”相关研究不同，承载力研究多是强调一定技术水平条件下，一个区域的资源或生态环境能够承载的、一定生活质量的人口、社会经济规模。
而生态足迹则是反其道而行之，一方面，它从供给面对区域的实际生物承载力进行测算，作为可持续发展程度衡量的标杆；更为重要的是它还从需求面试图估计要承载一定生活质量的人口，需要多大的生态空间，即计算生态足迹的大小。
随着科学技术的不断发展，生物基因工程作为一门新兴的综合性学科，在我国得到了广泛的应用和发展。
为了更好地了解生物基因工程的理论和实践，提高自己的专业素养，我于2022年7月1日至2022年7月31日在XX生物科技有限公司进行了为期一个月的生物基因工程实习。
二、实习目的1. 深入了解生物基因工程的基本原理和操作技术；2. 掌握实验室基本操作技能，提高实验操作水平；3. 培养团队合作精神和创新能力；4. 为今后从事生物基因工程相关领域的研究和工作打下坚实基础。
三、实习内容1. 实习单位介绍XX生物科技有限公司是一家专注于生物基因工程领域的高新技术企业，主要从事基因测序、基因编辑、基因治疗等方面的研发和应用。
公司拥有先进的实验室设备和技术团队，为我国生物基因工程领域的发展做出了重要贡献。
2. 实习项目（1）基因测序：学习并掌握DNA提取、PCR扩增、Sanger测序等基因测序技术，对样本进行基因测序，分析基因序列信息。
（2）基因编辑：学习CRISPR/Cas9等基因编辑技术，对目标基因进行定点修改，验证基因编辑效果。
（3）基因治疗：了解基因治疗的基本原理和操作流程，参与基因治疗项目的实施。
3. 实习过程（1）第一阶段：学习生物基因工程基本原理和操作技术，熟悉实验室设备。
（2）第二阶段：参与基因测序、基因编辑、基因治疗等项目的具体实施，提高实验操作水平。
（3）第三阶段：总结实习过程中的经验教训，撰写实习报告。
1. 理论知识方面：通过实习，我对生物基因工程的基本原理和操作技术有了更深入的了解，为今后从事相关领域的研究和工作打下了坚实基础。
2. 实践技能方面：在实习过程中，我熟练掌握了DNA提取、PCR扩增、Sanger测序、CRISPR/Cas9等实验操作技能，提高了自己的实验操作水平。
3. 团队合作方面：在实习过程中，我与团队成员共同完成了多个项目，培养了良好的团队合作精神。
4. 创新能力方面：在实习过程中，我积极思考，勇于尝试，提出了一些创新性的想法，为项目的实施提供了有益的建议。
实验一：大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备【实验步骤】1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基（250mL三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。
3 将菌液转移到50mL离心管（2管）中，冰上放置15min。
4 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液。
6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。
7 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。
8 分装到数个EP管中，每管200 uL，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（T-SOD或T-IL218）和表达载体质粒（PET32或PET30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混匀，冰上放置30min。
2、将EP管放到42℃保温90s，冰浴 2min。
3、加入800uL LB液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培养皿中，正置平皿30min （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管（20个每组）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。
3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。
4 加入350uL溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
《基因工程实训》总结报告实习总结第一天，我们是进行实验试剂的配置，以备实验过程中大家共同使用。
每组都有自己的任务，我们组是配置最后检测重组蛋白的制备SDS-PAGE电泳胶的试剂。
以及酵母划板培养。
试剂的配置是很关键的一步，如果没有依据要求配制试剂的话，可能会导致实验失败。
比如，最后一天在电泳时，样品一直都没有沉到点样孔底部，而marker却能沉下去，可能是因为sample buffer 的配置出了问题。
最终我们用了老师的buffer，效果有所改善。
却还是有上浮的迹象，也有可能是缓冲液的密度太大。
第二天，我们进行了PCR扩增产物、琼脂糖凝胶电泳检测产物、HindⅢ和Xba I双酶切、含载体的DH5α扩大培养等操作。
从中我学到了PCR仪器程序设置的方法。
以及对其它现有操作技术进行巩固和提升。
第三天，我们从大肠杆菌中提取了质粒载体，并且对其进行双酶切，与同样双酶切的目的基因进行连接，以及挑单克隆酵母过夜培养。
双酶切可以极大的避免载体与目的基因自身环化，提高了连接的效率。
通过实验，我能够更好的理解书本上的理论知识。
第四天，连接产物转化大肠杆菌。
通过热激的方法使带有目的基因的载体进入大肠杆菌细胞中，因为DNA是吸附在细胞表面的，因此在热激过程中避免晃动过大。
同样的在实验过程中，我们会注意到平时书本上不会注明的小点，但这往往也是实验成败的关键因素之一。
第五天，酵母感受态的制备与转化细胞应该处于对数生长期，是感受态细胞制备与成功转化的关键。
我们在实验过程中，OD600一直都无法达到0.4~0.6的范围。
可能是培养基的配置出了问题，也有可能是分光光度计本身的仪器问题。
我们为了达到一定的细胞数量取了两倍体积的菌液。
第六天、第七天，提取重组质粒酶切鉴定与酵母单克隆过夜培养。
真核表达系统有蛋白质的加工修饰系统，可以得到有生物活性的蛋白质。
且酵母是分泌型的表达系统，不仅不易被细胞内蛋白酶降解还可以免去破碎细胞提取蛋白的麻烦。
基因工程实验报告生命学院生技114班摘要：一、本次试验内容概况如下：（1）准备植物材料：小麦幼苗（2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。
（目的蛋白的大小会知道，高诱导。
证明符合预期结果。
说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。
）（5）用Weatern杂交去证明。
因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养具体实验过程：一、<一>小麦总RNA提取1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
基因工程实验报告基因工程实验报告引言：基因工程是一门前沿的科学领域，通过对生物体的基因进行编辑和改造，已经在医学、农业、环境保护等领域取得了重大突破。
本实验旨在探索基因工程的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
实验目的：本实验旨在通过基因工程技术将一种植物的抗虫基因转移到另一种植物中，以增强其抗虫能力。
通过此实验，我们希望验证基因工程在农业领域的潜力，为农作物的抗虫育种提供新的思路和方法。
实验方法：1. 选择目标基因：通过文献调研，我们选择了一种来源于大豆的抗虫基因。
2. 提取基因：使用PCR技术从大豆中提取目标基因的DNA序列。
3. 载体构建：将目标基因插入一个植物表达载体中，以便在目标植物中进行转基因。
4. 转基因：将植物表达载体导入目标植物细胞中，通过生物转化技术将目标基因导入目标植物的基因组中。
5. 筛选转基因植物：通过对转基因植物进行筛选和鉴定，确认是否成功将目标基因转移到目标植物中。
6. 抗虫性测试：将转基因植物和野生型植物分别暴露在虫害环境中，观察并比较它们的抗虫能力。
实验结果：经过实验，我们成功将大豆的抗虫基因转移到了目标植物中。
通过PCR技术和基因测序，我们确认了目标基因已经整合到目标植物的基因组中。
在抗虫性测试中，转基因植物表现出明显的抗虫能力，相比野生型植物，其受虫害程度明显降低。
讨论与分析：本实验结果表明，基因工程技术可以成功地将抗虫基因转移到目标植物中，从而提升其抗虫能力。
这为农作物的抗虫育种提供了新的思路和方法。
通过基因工程，我们可以将不同物种的有益基因导入到目标植物中，从而增强其抗虫性、抗病性等特性。
这对于农业生产的可持续发展和环境保护具有重要意义。
然而，基因工程也面临一些挑战和争议。
一方面，基因工程技术的应用需要谨慎，确保对环境和生态系统的影响可控。
另一方面，基因工程的伦理和道德问题也需要认真思考和讨论。
因此，在推动基因工程技术的发展和应用时，我们需要综合考虑科学、环境和社会的各种因素。
一、实验目的1. 学习并掌握基因工程的基本原理和操作技术；2. 熟悉基因克隆、表达、检测等实验操作；3. 培养实验操作技能和科学思维能力。
二、实验原理基因工程是利用分子生物学和生物化学原理，通过人工手段对生物的遗传物质进行改造，以达到改变生物特性、提高生物产量、生产新生物制品等目的的技术。
实验中主要涉及以下原理：1. 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：能够识别特定的核苷酸序列，并在该序列的特定位置切割DNA链；2. DNA连接酶（DNA ligase）：能够将两个DNA片段连接起来；3. 转化：将外源DNA片段导入受体细胞；4. 转录和翻译：将目的基因转录成mRNA，再翻译成蛋白质。
三、实验材料1. 质粒载体：pET-28a、pUC19等；2. 限制性核酸内切酶：EcoRI、HindIII等；3. DNA连接酶：T4 DNA连接酶；4. 转化试剂：钙离子、转染试剂等；5. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、KCl、MgCl2、DNA模板、引物、dNTPs、PCR试剂等；6. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、超净工作台等。
四、实验步骤1. 设计实验方案：根据实验目的，设计实验步骤，包括目的基因的克隆、表达、检测等。
2. DNA提取：采用CTAB法提取质粒DNA。
3. 限制性核酸内切酶酶切：将质粒DNA和目的基因片段分别进行EcoRI、HindIII酶切，酶切产物进行电泳鉴定。
4. DNA连接：将酶切后的质粒DNA和目的基因片段进行连接，连接产物进行电泳鉴定。
5. 转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆。
6. 阳性克隆的鉴定：通过PCR、测序等方法对阳性克隆进行鉴定。
7. 重组质粒的提取：提取重组质粒，进行电泳鉴定。
8. 重组质粒的表达：将重组质粒转化到大肠杆菌表达系统中，进行诱导表达。
9. 目的蛋白的纯化：采用离子交换层析、亲和层析等方法对目的蛋白进行纯化。
大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测（基因工程实验报告）程庆佳（云南大学，生命科学学院，生物技术，20091070004）（班级：周二下午实验班; 组号:第八组; 老师：赖建华；同组员：顾聚）摘要：此次实验的目的是对大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测，其中的关键步骤包括了大肠杆菌基因DNA的提取，PCR扩增，DNA体外重组，感受态细胞的制备，重组DNA的转化，重组转化的检测等多种具有紧密连接性的实验，使学生可以掌握一套具有连贯性的实验过程，帮助学生塑造连贯试验的观念，从而得到更好地成长与进步。
关键词：提取、扩增、重组、感受态细胞、转化、检测正文：此次实验的最终目的是要使学生连贯性的掌握本学期的实验，所以要求我们要熟悉每个实验的原理过程，以及实验结果的准确分析，只有这样才能保证实验最终结果的准确性，才能真正地掌握此次实验。
1、大肠杆菌基因组DNA的提取原理： DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。
不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K 的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
简要步骤：（1）、菌种活化：将菌落接种于LB培养基中，37度培养过夜（2）、取1ml菌液转入1.5ml离心管中，5000rpm离心1分钟，去上清。
（3）、加入500ulTE，50ul 10% SDS，5ul蛋白酶K，混匀，55度，保温20min（4）、加入50ul，5M Nacl混匀，再加入50ul CTAB 提取液，混匀，65度，20min （5）、去蛋白：300ul的酚和氯仿，轻轻混匀，10000rpm，2min（6）、上清转入另一个干净的1.5ml离心管，加入等体积氯仿异戊醇，轻轻混匀，10000rpm，2min，上清转入干净的1.5ml离心管中（7）、加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的无水乙醇轻轻旋转小试管，可见絮状沉淀，即为染色体丝，10000qpm，3min收集沉淀（8）、弃上清，沉淀用500ul 75%乙醇洗涤两次（每次10000rpm离心1min）（9）、室温下稍干，加适量（约50ul）RTE溶解，37度 30min（10）、电泳观察结果1 2如图所示，1号为本组实验结果。
对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。
出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。
本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。
RNA含量很大，所以显示比较清晰。
在电泳过程中应注意的是胶浓度要与DNA分子量呈线性关系，所以胶浓度对于实验结果检测的成败有重要的意义。
另外，在实验过程中应避免用力，以此来保障DNA样品结构的完整性与稳定性。
2、PCR扩增目的基因核糖核苷酸酶HII基因原理：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术。
该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。
PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。
PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA 互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。
反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。
PCR 反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA 为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。
这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。
PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。
简要步骤：（1）、在PCR管中加入所需试剂和样品。
（2）、将PCR管放入事先调好的PCR仪中，进行PCR（3）、PCR后，对样品进行电泳检测结果。
如图所示，对比第一个条带maker，右边的条带可以看到PCR进行的较为成功，DNA 条带下并无明显的其他条带，所以DNA的纯度较高，并无杂质RNA与蛋白。
由样品对比的明暗度可以看出，较为明亮的DNA含量较多，反之一样。
此次实验主要要求学生掌握PCR反应仪的使用方法以及电泳反应条带的正确分析，从而得到正确的实验结果。
3、PMD-RNase HII DNA 体外重组原理：DNA重组是指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。
DNA体外重组技术是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。
DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子和外源DNA分子进行连。
常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性开端的DNA分子连接在一起，而且能使平端的双链DNA分子连接在一起，但平端连接的热效率要比粘性末端连接效率低。
连接反应温度在37度时利于连接酶的活性，但在此温度下，粘性末端的氢键结合不稳定。
一般的连接条件是12-16度，反应12-16小时，这样既可最大限度的发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还需对转化菌进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
简要步骤：（1）、10%琼脂凝胶电泳，用6孔梳子做胶，将扩增剩余产物全部上样电泳。
（2）、切胶，回收。
加入400ul溶胶液Binding Buffer ，55度溶胶（3）、装柱：将溶解好的溶液加入回收柱中，并将回收柱套入2ml废液管中。
（4）、12000rpm离心30秒，去除废液。
（5）、漂洗：将500ul漂洗液wash solution 加入回收柱中，并将回收柱重新套入2ml的废液管中，12000rpm离心30秒，去除废液（6）、重复漂洗一次去除废液。
（7）、12000rpm离心2min，将回收柱套入纯净无菌的1.5ml离心管（8）、向回收柱的正中央加20ul洗脱buffer，50度放置15分钟（9）、12000rpm离心2分钟，1.5ml离心管底部的溶液即为回收的DNA4 1 2 3此电泳图是PCR产物回收检测的电泳图，是为了检测两种试验样品是否可以继续使用，由图中可以看到1号为对照条带，2、3两个样品的条带较为清晰，所以可以使用，并且4号为重复样品。
之后进行2、3两种样品的切胶回收。
1 2 3此图中1号为对照条带maker，2、3号为切胶回收样品，样品中没有杂质，样品条带较为模糊，表明回收的样品含量较少，但是还可以勉强使用。
最后在小离心管中加入5ul胶回收的PCR产物，再加5ul solution I连接反应液，加0.5ul的pmd18-T Vector DNA，混匀后，于16度反应30分钟以上即为重组子。
此次试验要求我们掌握切胶的过程，亲自动手进行实践，还使我们熟悉了重组子构建的步骤与过程，熟悉DNA体外重组。
4、大肠杆菌感受态细胞制备原理：本次试验采用CaCl2制备大肠杆菌的感受态细胞。
所谓的感受态，是指受体最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
Ca也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或—70度保存。
简要步骤：（1）、取冻存宿主菌一环，接于LB无抗平板培养基上，37度培养过夜（2）、取培养菌液1.5ml转入1.5ml离心管中，在冰上冷却10min，于4度，4000rpm离心5分钟（3）、倒净上清培养液，用750ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10min （4）、4度，4000rpm离心5分钟（5）、弃上清，加入500ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。
冰浴10min，4度，4000rpm离心5分钟（6）、弃上清，加入50ul冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，放在冰上片刻后，即制成了感受态细胞悬液；冻存。
本次试验较为简单，主要是进行重复的CaCl2溶液的添加，之后离心处理，其中的关键在于冰浴温度的控制以及无菌的操作条件，所以操作要快速并且保障准确性，还要准确计量时间。
感受态细胞转化效率的影响因素（1）细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
