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登革热胶体金法
摘要：
1.登革热胶体金法的概述
2.登革热胶体金法的原理
3.登革热胶体金法的操作步骤
4.登革热胶体金法的优点与局限性
5.登革热胶体金法在我国的应用现状
正文：
一、登革热胶体金法的概述
登革热胶体金法是一种检测登革病毒的方法，该方法采用胶体金技术，通过检测样本中登革病毒的抗原或抗体，从而判断被检测者是否感染了登革病毒。
二、登革热胶体金法的原理
胶体金法的原理是利用胶体金与抗原或抗体的特异性结合，形成肉眼可见的红色沉淀，从而判断被检测者是否感染了登革病毒。
三、登革热胶体金法的操作步骤
1.准备样本：采集被检测者的血液或尿液样本。
2.制备试剂：将胶体金与登革病毒的特异性抗体结合，制备成检测试剂。
3.滴定：将被检测者的样本滴在检测试剂上，观察是否出现红色沉淀。
四、登革热胶体金法的优点与局限性
优点：操作简便，结果快速且直观，适合现场检测。
局限性：可能会受到其他病毒或细菌的干扰，需要与其他检测方法结合使
用以提高准确性。
五、登革热胶体金法在我国的应用现状
登革热胶体金法在我国的应用已经相当广泛，尤其在登革热疫情高发区的防控工作中，该方法起到了重要的作用。
登革热IgG/IgM/NS1检测试剂盒（胶体金法）登革热IgG/IgM/NS1检测试剂盒是一种胶体金检测法，用于同时快速检测血清、血浆、全血标本中的登革热NS1抗原和登革热IgG / IgM抗体。
测试结果旨在帮助诊断登革热。
【检验原理】登革热检测试剂盒采用胶体金技术来定性检测全血/血清/血浆中是否含有登革热病毒IgG、IgM和登革热NS1抗原。
试剂盒含有被事先固定于膜上测试区的两条T线上的抗人IgM、抗人lgG抗体和抗SN1抗体和质控区(C)的相应抗体。
测试时，将全血/血清/血浆标本滴加于试剂条加样区，全血/血清/血浆标本与预包被的标记颗粒结合。
然后混合物随之在毛细效应下向上层析，如是阳性，混合物在层析过程中分别与标本中的登革热抗体IgG 或IgM或者登革热NS1抗原结合，随后结合物会分别被固定在膜上抗人IgG、抗人IgM和抗SN1抗体结合，在测试区(T1，T2，T3)内会出现红色条带。
如果在测试区(T1，T2，T3)内没有出现红色条带，则血标本中不含有登革热病毒，表明是阴性结果。
无论登隔热病毒抗体是否存在于血液标本中，混合物都会继续向上层析至质控区(C)，质控区的相应抗体与混合物反应出现一条红色条带。
质控区(C)内所显现的红色条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
【检验方法】1.检测前应将未开封的试剂条置于室温中，使试剂的温度达到平衡。
2.依据产品类型进行检测条型产品：血清血浆：将试纸的加样端插入待检样本中(注意不要超过MAX线)等待5-20秒，等样本在NC膜上层析时取出，平放后开始计时。
全血：用吸管吸取样本，然后垂直滴加1-2滴于加样端,然后滴加1-2滴稀释液，加样后开始计时。
卡型产品：血清血浆：沿切口部位撕开铝箔袋，取出试剂条平放在干净的台面上，用吸管吸取样本，缓慢滴加3滴于加样孔上，开始计时。
全血：用吸管吸取样本，然后垂直滴加1-2滴于加样孔,然后滴加2滴稀释液。
加样后开始计时。
疑似登革热疫情标本检测方法分析引言登革热是一种由登革病毒引起的传染病，其传播途径主要为蚊虫叮咬，主要传播媒介为埃及伊蚊和亚洲虎蚊。
登革热病毒感染后，患者的临床表现多种多样，包括发热、头痛、肌肉和骨骼痛，也有严重的情况会引发出血症状。
在许多地区，登革热的疫情一直是一个严重的公共卫生问题，因此对于疑似登革热患者的标本检测显得尤为重要。
本文将从疑似登革热病毒标本的采集、处理和检测方法等方面进行分析，为疑似登革热病例的诊断提供参考。
一、疑似登革热标本的采集1. 血清标本的采集疑似登革热患者的血清标本是进行登革热病毒检测的重要样本之一。
血清标本的采集需要在患者发病的第3-7天进行，因为这个时间段是病毒在血液中的高峰期。
采集血清样本前，首先需要对患者进行严格的蚊虫叮咬预防措施，以避免交叉感染。
采集血清标本时需要使用抗凝血管，避免血液凝固影响检测的准确性。
血清标本采集完成后，需要立即进行标本的冷链运输，避免温度过高导致病毒失活，影响后续的检测结果。
2. 其他标本的采集除了血清标本外，疑似登革热患者的其他生物标本如尿液、唾液、组织等也可以用于登革热病毒的检测。
对于这些标本的采集，同样需要在患者发病的第3-7天进行，并严格按照标本采集的规范进行操作。
在采集过程中需要避免污染，以保证标本的纯净度和准确性。
二、标本的处理和保存1. 血清标本的处理和保存采集到的血清标本需要在采集完成后立即进行离心分离，分离后的血清需要存放在-70℃以下的冷冻箱中保存，并避免多次冻融，以避免病毒失活。
在血清标本离心分离的过程中也需要严格的无菌操作，避免细菌污染对病毒检测结果的影响。
三、标本的检测方法1. 血清标本的检测目前对于登革热病毒的检测方法主要有血清学检测和分子生物学检测两种方法。
血清学检测主要是通过补体结合试验（HIT）和中和试验（NT）进行病毒抗体的检测，从而判断患者是否感染了登革热病毒。
而分子生物学检测则是通过PCR（聚合酶链反应）等方法来检测病毒的核酸，从而判断病毒的存在和数量。
登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验在登革热实验室诊断中的应用价值目的：旨在检测登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验在登革热实验室诊断中的应用价值，为登革病毒早诊早筛提供帮助。
方法：选取2012-2016年间于本院就诊的疑似登革病毒感染患者的血清学标本共362例，通过过胶体金免疫层析法、荧光聚合酶链式反应以及NS1-ELISA试验对登革热诊断的灵敏度、特异性、阳性及阴性预测值、阳性及阴性似然比和约登指数等统计学指标进行比较。
结果：三种检测方法中，金标法具有较高的检测率（64.64%），然而其灵敏度和特异性较差（分别为87.80%和65.61%）；NS1-ELISA试验具有较高的灵敏度（91.22%）、阴性预测值（87.50%）及约登指数（0.71）和较低的阴性似然比（10.94%）；qPCR法则具有较高的特异性（85.99%）、阳性预测值（88.72%）和阳性似然比（598.51%）。
三种检测方法的灵敏度比较差异均无统计学意义（P>0.05）；金标法和qPCR法的特异性比较差异有统计学意义（P＜0.01），其他无统计学意义（P>0.05）。
结论：登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验的检测效能较优，在登革热的诊断中具有一定的应用价值，能够为登革热的早诊早筛提供帮助。
登革熱是热带亚热带地区极为高发的传染病[1]，致病病原体登革病毒是黄病毒属的重要成员[2]，以伊蚊作为传播媒介[3]。
目前，针对登革病毒仍无行之有效的特效药和疫苗[4]，因而，对登革热的早期诊断显得尤为重要。
登革病毒非结构蛋白NS1在病毒的感染、复制及致病过程之中具有至关重要的作用。
研究证实，NS1蛋白在4种病毒血清型间高度保守，其在血清中的检测常早于IgM 抗体和RNA的产生，在登革热的早期诊断中具有重要作用[5]。
针对登革病毒的检测常用的初步诊断方法为胶体金免疫层析法（以下简称为金标法），待检测结果确定为阳性后，采用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）对送检样本进行确诊。
登革热实验室检查结果登革热是一种由登革病毒感染引起的病情严重的疾病，其临床表现多种多样，包括发热、头痛、关节痛、肌肉痛、皮疹等症状。
为了准确诊断登革热，医生通常会进行实验室检查，以便及时采取适当的治疗措施。
下面我们将详细介绍登革热实验室检查的结果解读，为大家提供指导意义。
1. 血液检查：在登革病毒感染后，患者的血液中可以发现一些特殊的指标，这些指标有助于诊断登革热。
常见的检查指标包括白细胞计数和血小板计数。
在登革热病例中，白细胞计数通常是正常的或轻度下降的，而血小板计数则明显下降。
2. 血小板压积：血小板压积是衡量血小板数量和功能的一个重要指标。
登革病毒感染会导致血小板减少，同时血小板功能也受到损害。
因此，患者的血小板压积通常偏低。
3. 登革病毒特异性抗体检测：登革热是由登革病毒引起的，身体在感染后会产生相应的抗体来抵抗病毒。
通过检测特异性抗体，可以确定患者是否已经接触过登革病毒。
这种检测方法通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或血清中的中和抗体试验。
4. 病毒核酸检测：登革病毒的核酸检测是目前最可靠的诊断方法之一。
通过提取患者血液中的RNA或DNA，利用聚合酶链式反应（PCR）技术可以直接检测登革病毒的存在。
这种方法不仅可以确定患者是否感染了登革病毒，还可以区分不同亚型的登革病毒。
5. 细胞培养：细胞培养是一种传统的登革病毒检测方法，通过将患者血液或组织标本接种到细胞培养基上，培养出登革病毒。
这种方法可以进一步确定病毒的亚型，并用于病毒发展和抗病毒药物的研究。
综上所述，登革热的实验室检查结果可以为医生提供重要的诊断依据。
通过血液检查、特异性抗体检测、病毒核酸检测以及细胞培养等方法的综合应用，可以准确判断患者是否感染登革病毒，并进一步了解病毒的亚型。
这些结果对于制定合理的治疗方案、防控措施和疫情监测具有重要的指导意义。
同时，我们也应该注意，实验室检查结果仅作为辅助诊断的参考，综合临床症状和流行病学调查等因素，以确保准确诊断和及时治疗。
附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体 试验材料： （1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存； （2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）； （3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体； （4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等； （5）荧光显微镜。
检测步骤： （1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断： 细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义： 阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义； 恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测单份和/或双份血清IgG抗体 试验材料： （1）抗原： 阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体； （3）缓冲液： 包被液：pH9.6碳酸缓冲液； 稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶） 洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）； （4）显色液：A/B液 （5）终止液：4NH2SO4 （6）酶标板、酶标仪。
登革热抗体(DF-Ab)ELISA试剂盒说明书登革热抗体(DF-Ab)ELISA试剂盒说明书产品规格：96T/48T。
供应商：上海乔羽生物有限公司上海乔羽有限公司，有elisa试剂盒，抗体，培养基登革热抗体(DF-Ab)ELISA试剂盒说明书ELISA试剂盒具有以下特点：1.专一性强。
抗原与抗体的免疫反应是专一反应，而免疫酶技术以免疫反应为基础，所检测的对象是抗原（或抗体），使用的抗体除标记了酶以外，与普通抗体的免疫反应特性并无多大差别。
2.灵敏度高。
由于抗体联结上了酶，因此，借助于酶与底物的显色反应，显示抗原与抗体的结合，大大提高了检测的灵敏性，使检测水平接近放射免疫测定法。
3.样品易保存。
经过酶反应显示的有色产物大多比较稳定，因此有利于样品的保存。
4.结果易观察。
对检测结果即可用肉眼观察，又可用显微镜观察，也可以用分光光度计进行比色测定，还可用显微镜观察。
这是因为某些酶反应产物能使电子密度发生改变，从而引起被检测物的显示。
5.可以定量测定。
溶液中的抗原物质，应用酶免吸附技术进行比色测定，依据光密度值的变化，可以定量。
预计用细胞分光光度计可对组织内的抗原进行免疫酶技术的定量测定。
6.可以大规模测定样品。
如有成千上万份样品需要进行检测，免疫酶技术都能在较短时间内完成。
7.仪器和试剂简单。
对免疫没技术来说，不需要荧光显微镜，也不需要测定放射性的特殊仪器，所用仪器及试剂均属一般性仪器与试剂，普通实验室及生产应用单位均易购置登革热抗体(DF-Ab)ELISA试剂盒说明书Kit130 times concentrated washing liquid 20ml x 1 bottles; 2 x 1 bottle 6ml ELISA Kit3 ELISA plates coated with 12 holes x 8;4 x 1 bottles of 6ml sample diluent5 color reagent A liquid 6ml * 1 bottle;6 color agent B liquid 6ml * 1/ bottle7 termination solution 6ml * 1 bottle;8 standard product (48ng/ml) 0.5ml * 1 bottle9 standarddiluent 1.5ml x 1 bottles;10 Manual 111 closure plate membrane 2; 12 sealed bag 1登革热抗体(DF-Ab)ELISA试剂盒说明书试剂盒特性◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
登革热疾病的流行特征及病毒检测文艳琼;朱柏珍;黄爱群;徐明霞;钟秀茵【摘要】目的结合登革热疫情的流行病学资料,探索登革热病毒检测的实验室诊断方法.方法选择2014年1～12月广州医科大学附属第五医院收治的登革热患者2 158例.分析登革热疫情的发病情况,包括发病年龄、发病时间和发病患者职业等,采用免疫层析(ICT)法、酶联免疫吸附(ELISA)法及核酸检测PCR法检测登革热病毒,分析检测结果.结果 2158例登革热患者中普通型登革热2 017例,占93.47％,重症登革热141例,占6.53％.登革热病例发病时间主要集中在8～11月,占99.54％,10月份发病例数最多,为1 226例,占56.81％.登革热病例的年龄段主要集中在21～60岁,占74.70％,21～30岁发病例数最多,为530例,占24.56％.登革热病例主要集中在待业(26.18％)、离退休人员(6.35％)和商业服务(6.35％)人群,医务人员(0.42％)和餐饮食品业(0.42％)的患者较少.ELISA法和核酸检测PCR法的总阳性率较高,ICT法的阳性率较低,ELISA法和核酸检测PCR法的灵敏度较高,三者特异度相差不大.发病1～5 d的血清,核酸检测PCR法的灵敏度最高,而发病6～7 d的血清,ELISA法的灵敏度最高.结论登革热疫情的发病时间集中在8～11月,年龄段主要集中在21～60岁,职业主要是待业人员,ELISA和核酸检测PCR法的总阳性率和灵敏度较高.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2016(013)011【总页数】3页(P1459-1461)【关键词】登革热;流行特征;酶联免疫吸附法;免疫层析法;核酸检测PCR法【作者】文艳琼;朱柏珍;黄爱群;徐明霞;钟秀茵【作者单位】广州医科大学附属第五医院检验科 510700;广州医科大学附属第五医院检验科 510700;广州医科大学附属第五医院检验科 510700;广州市黄埔区疾病预防控制中心 510700;广州市黄埔区疾病预防控制中心 510700【正文语种】中文登革热和登革出血热是由登革热病毒引起的热带虫媒传染病，登革热病毒流行于全球热带和亚热带的60多个国家和地区，以东南亚国家最为严重[1-2]。
panbio登革热IgM 捕获ELISA法Cat No. E-DEN01M预定用途：Panbio登革热IgM 捕获ELISA法是一种定量检测血清中登革热IgM抗体的方法，可以作为临床具有登革热症状病人的临床实验室检测辅助手段。
Panbio 登革热捕获ELISA法应和其它的登革热血清学方法联合应用。
序言：登革热，黄病毒属(B群黄病毒)，广泛存在于热带和亚热带地区。
通过蚊子，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。
感染了登革热病毒在临床上可以引起一系列从不明显到致死性的登革出血热症状。
典型登革热症状表现为突然发热、激烈头痛、肌痛、关节痛和出疹。
还有二相热型、失眠、由于味觉丧失或苦味导致的厌食等也很常见。
登革出血热和登革休克综合征经常是伴随二次血清感染出现的严重并发症。
登革热病毒IgM抗体ELISA检测法是一种很有用的方法，尤其是在二次和后继的多次感染中，那时并发症的发生率很高。
登革热病人的血清IgM抗体能在发热后3~5天就能检测并通常能持续30~90天，虽然检测水平可能在感染后的8个月都可存在。
原理：IgM群血清抗体和粘附在微孔测试板聚笨乙烯表面上的抗人IgM抗体相结合。
用抗原稀释液把登革热1~4号抗原浓缩液稀释到恰当的工作容量。
抗原由昆虫细胞表达系统和一种免疫纯化的单克隆抗体制得而成。
在稀释抗原中加入适量的辣根过氧化物酶（HRP）结合单克隆抗体（MAb）形成抗原-MAb复合物。
洗去测试板内的残存血清，加入抗原-MAb复合物。
孵育后，洗涤微孔板，加入无色底物，四甲基联苯胺/过氧化氢（TMB/H2O2）。
底物被酶水解后变成蓝色。
加酸终止反应后，TMB变成黄色。
颜色的变化表明测试样本中有抗登革热IgM抗体。
提供的材料：1．抗-人IgM包埋微孔板—（测试板）微孔用抗-人IgM抗体包埋（12*8个孔）。
备用。
不用的微孔板立即收好，贮存在有干燥剂的地方。
在2-8ºC稳定至失效。
2. 登革热1-4号抗原（重组体）—一个透明有盖的玻璃瓶，150 μL（蓝色）浓缩的登革热病毒抗原1,2,3和4号。
没有用过的稀释的抗原一定要扔掉。
浓缩的抗原贮存于2~8度直至失效。
3. 洗涤缓冲浓缩液—一瓶60ml用吐温20和防腐剂（0.1% ProclinTM）20倍浓缩的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2-7.6)。
在低温下可能会形成结晶。
为避免这种情况，把它放在37ºC直至变得透明。
充分混匀。
在1份洗涤缓冲浓缩液加入19份蒸馏水稀释。
稀释的缓冲液在2~25ºC可以贮存一个星期。
4. 血清稀释液-两瓶50ml装（粉红色）。
备用。
三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(pH 7.2-7.6) 含防腐剂（0.1% Proclin）和添加剂。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
5. 抗原稀释液-一瓶50ml装（透明色）。
备用。
磷酸盐缓冲液含防腐剂（0.1% ProclinTM 和0.005% 庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
6. 辣根过氧化物酶共轭单克隆抗体示踪剂-一瓶7ml装（黄色）。
备用。
辣根过氧化物酶共轭单克隆抗体示踪剂含防腐剂（0.1% Proclin.）和蛋白稳定剂。
在2~8度保持稳定直至失效。
7. 四甲基联苯胺TMB-一瓶15ml装。
备用。
3,3,5,5'-TMB和枸酸盐缓冲液（pH 3.5-3.8）内的过氧化氢的混合物。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
8. IgM阳性对照血清-一个黑色有盖的瓶子装有200 μL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
9. IgM标准血清-一个橙色有盖瓶子装有400μL人血清（内含0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
10. IgM阴性对照血清-一个白色有盖的瓶子装有200 μL人血清（含有0.1%叠氮化纳和0.005%硫酸庆大霉素）。
在2~8ºC保持稳定直至失效。
11. 终止液-一个瓶子15ml装。
备用。
1M磷酸。
在2~25ºC保持稳定直至失效。
Proclin. 300是Rohm and Haas公司的注册商标产品对照和标准血清安全注意事项：在这些成份里叠氮化纳的浓度是有毒性的，是属于下列级别(R22, R32)的：“吞食有毒”和“和酸接触会释放出有毒气体”另外必需具备但不提供的材料：(1) 精确可调节微量移液器（5-1000 μL容量），配备一次性使用吸管(2) 去离子水(3) 微量培养板洗涤系统(4) 酶标仪配备450nm滤波片(5) 计时器(6) 刻度量筒(7) 烧瓶(8) 血清稀释用的试管或微量滴定板(9) 抗原稀释用的玻璃或塑料试管或瓶。
警示用于体外诊断用(i)用在准备对照时的所有人类来源的材料在测试对人类缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗体时，都为阴性。
但是没有哪种方法能够完全保证，所以所有的人体对照和抗原都应该认为是潜在的感染源。
疾病预防控制中心和国家健康署建议可能传染的抗原应该在2级生物安全下进行处理。
(ii)这种测试只能用血清。
用全血、血浆或是其它的样本间质不能做。
(iii)黄疸的或黄体脂蛋白血清，或表现出溶血的，或有细菌生长的血清都不可用。
(iv) 不要加热失活的血清。
(v) 在开始实验前，所有的试剂必须要平衡至室温（20~25ºC）。
试验受到室温变化的影响。
只有达到了室温才能把微孔板从密封包里拿出来。
(vi) 用干净的枪头直接在瓶子里配试剂。
转移试剂可能会导致污染。
(vii) 未用过的微孔板，应立即重新封存，并储存有干燥剂的地方。
如果不这样做可能会造成错误的结果。
(viii) 底物系统(a) 由于TMB易受金属离子污染影响,所以不允许底物系统和金属表面接触。
(b) 避免长时间暴露于阳光直射下。
(c) 一些洗涤剂可能会干扰TMB的表现。
(d) TMB可能会有一些淡蓝色。
这个不会影响底物的活性或者试验的结果。
警告(ix)这些试剂盒成份内含有叠氮化钠，它可能与铅或铜管道反应形成高爆炸性金属叠氮化合物。
当通过水管装置来去除这些试剂时，用大量的水冲洗以防止叠氮积聚在排水管。
(x) 叠氮化钠会抑制结合物的活性。
必须用干净的移液管枪头来加结合物以致叠氮化钠不会被其它试剂携带污染。
为获得更多的安全信息请参照从PANBI0得到的原料安全数据表（MSDS）.标本收集和准备让静脉血在室温下（20~25ºC）凝结成块，然后根据全国临床实验标准委员会(NCCLS)（收集诊断静脉血的认可标准程序，H3-A4, 1998）进行离心。
血清应尽快分离并冷藏（2~8ºC），如果在两天内不试验的话，就应该冷冻（-20ºC或更低的温度）。
不推荐使用自我解冻的致冷机。
黄疸血清、有溶血的、脂血的或是有细菌生长的血清都不推荐使用。
CLSI提供贮存血样的建议。
（血样处理加工的认可标准程序，H18-A2, 1999）。
测试程序注意：确保在实验前，所有的试剂都平衡至室温（20~25ºC）。
在超出所提供的时间和温度范围内试验可能会导致无效的结果。
没有在即定的时间和温度内进行的试验应重复一次。
血清预稀释(i) 从箔袋内拿出所需数量的微孔板，并插入夹板固定器。
5个板分别是阴性对照，阳性对照和三个标准物。
确保剩下未用的微孔板紧紧地密封在箔袋内。
(ii) 用合适的试管或微量滴定板稀释阳性对照，阴性对照，标准物和病人样品。
(a) 在10μL血清中加入1000μL血清稀释液。
充分混匀。
或者(b) 在10μL血清中加入90μL血清稀释液。
取出20μL稀释的血清加入180μL血清稀释液。
充分混匀。
ELISA操作步骤方法概括参见附图(a)抗原(i) 确定好你试验所需孔的数量。
用抗原稀释液稀释抗原1/250。
建议最少要稀释10μL 抗原至2.5ml抗原稀释液。
这样才足够做5条带（共有40个孔）。
每条带都需要0.5ml稀释的抗原。
一旦抗原被加入了抗原稀释液，那溶液就会变成淡蓝色。
确保剩下没用的浓缩抗原贮存在2~8 ºC。
(ii) 取出需要量的稀释抗原，然后在一个干净的玻璃或塑料瓶里混合相同体积的MAb 示踪剂。
轻轻地混匀抗原和MAb 示踪剂溶液，再在室温下保持至所需时。
弃掉没用过的稀释抗原。
(b) 测试板(iii) 混匀后10分钟内，吸取100μL稀释的病人样本和对照，分别加入测试板相应的微孔内。
(iv) 盖上测试板，在37 ºC±1 ºC孵育1小时。
(v) 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。
（参见下面的冲洗步骤）(vi) 混匀抗原和MAb示踪剂。
吸取100 μL混匀物，加入测试板相应的孔内。
(vii) 盖上测试板，在37 ºC±1 ºC孵育1小时。
(viii) 用稀释的洗涤缓冲液冲洗6次。
（参见下面的冲洗步骤）(ix) 在每个孔内加入100 μLTMB。
(x) 从第一次加入算起，在室温下(20-25 ºC)培育10分钟。
蓝色将会出现。
(xi) 按TMB加入的时间和顺序，在所有的孔内加入100 μL终止液。
混匀。
蓝色将会变成黄色。
(xii) 30分钟内读数，波长450nm，参照滤波器600~650nm。
注意：如果是双波长分光光度计，在600~650nm间设定参照滤波。
如果在450nm 读数没有参照滤波时，可能会由于背景因素出现更高的吸光值。
冲洗步骤：有效的冲洗能去除没有混合的样品或成分，这对于ELISA程序是很有必要。
A. 全自动冲洗板(1) 吸光所有孔内容物。
(2) 在冲洗过程中，洗涤缓冲液要注满孔（350 μL）(3) 6次冲洗完后，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
(4) 全自动冲洗板一定要维护好，确保冲洗效果。
在所有时间内都要遵照制造商的冲洗说明。
B. 人工冲洗(1) 把内容物倒入合适的废物缸。
(2) 用一个合适的挤压瓶把洗涤缓冲液加满孔，避免起泡，因为这可能会降低冲洗效果。
立即倒掉缓冲液。
(3) 重新加满，再立即倒掉。
(4) 再重复4次步骤3。
总共用洗涤缓冲液洗6次。
(5) 洗完最后一次后，倒掉孔内容物，把板翻转，在吸水纸上用力敲打确保去除所有的冲洗缓冲液。
质量控制：每个试剂盒包括标准物，阳性对照和阴性对照血清。
在随附的说明表列有这些血清合适值。
那阴性和阳性对照是用来监测由试剂引起的失败。
阳性对照不能确保试验临界点的精确度。
如果对照或标准的吸光度值没有达到说明书标准，则测试无效，就应该重做。
如果测试无效，病人结果就不能报告。
质量控制需要必须遵照当地的、州和/或国家法律或委任书和你们实验室标准质量程序。
建议用户参照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202(c)中的合适的质量控制实践指导。
