葡萄果穗附生微生物区系分析_郭继平

果树资源学报 2023,4(4):73-79水果采后致病菌及拮抗酵母防治机制研究进展蔺 楠,杜静婷,施俊凤*,张立新*(山西农业大学食品科学与工程学院,山西太原030031)收稿日期:2023-04-20基金项目:山西省自然科学基金项目(面上)(20210302123422);山西省重点研发计划项(202102140601017);山西省现代农业产业技术体系(果树)建设专项资金(S X F R S -2022)㊂第一作者简介:蔺 楠(1998-),女,硕士在读,主要从事果蔬采后病害和生物防治研究㊂*通信作者:施俊凤(1977-),研究员,主要从事果蔬采后病害和生物防治研究㊂E -m a i l :s j f t y @126.c o m 张立新(1966-),研究员,主要从事果蔬贮藏保鲜技术研究㊂E -m a i l :139********@139.c o m摘 要:水果由于其含有丰富的营养物质,成为人类饮食中不可或缺的重要资源㊂但是水果在采收后处理不当会造成腐烂,带来严重亏损㊂这些腐烂主要是由真菌导致,其包括扩展青霉㊁灰葡萄孢霉㊁链格孢菌㊁曲霉和毛霉等㊂真菌不仅侵染果实导致腐烂,而且可分泌毒素,引发食品安全问题㊂酵母菌防治由于不产生有害代谢物,对环境友好,成为水果采后病害防治及真菌毒素降解的新策略㊂综述了采后常见病原真菌及其对水果的侵染特性,果实采后致病菌的侵染机理,以及酵母菌的生防机制㊂关键词:水果;采后病害;真菌毒素;拮抗酵母;生物防治文章编号:2096-8108(2023)04-0073-07 中图分类号:S 436.611.1+6 文献标识码:AR e s e a r c h P r o g r e s s i n C o n t r o l M e c h a n i s m o f P o s t h a r v e s t F r u i t P a t h o g e n i c B a c t e r i a a n d A n t a go n i s t i c Y e a s t L I N N a n ,D U J i n g t i n g ,S H I J u n f e n g *,Z H A N G L i x i n *(C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g ,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,T a i yu a n S h a n x i 030031,C h i n a ) A b s t r a c t :F r u i t h a s b e c o m e a n i n d i s p e n s a b l e a n d i m p o r t a n t r e s o u r c e i n h u m a n d i e t b e c a u s e o f i t s r i c h n u t r i e n t s .H o w e v e r ,f r u i t i s p r o n e t o d i s e a s e a f t e r h a r v e s t ,r e s u l t i n g i n d e c a y a n d s e r i o u s l o s s e s .F u n g i a r e t h e m a i n p a t h o g e n s c a u s i n g f r u i t d e c a y.T h e s e f u n g i m a i n l y i n c l u d e P e n i c i l l i u m e x p a n s u m ,B o t r y t i s c i n e r e a ,A l t e r n a r i a ,A s p e r g i l l u s a n d M u c o r .F u n g i n o t o n l yi n f e c t f r u i t a n d c a u s e r o t ,b u t a l s o s e c r e t e t o x i n s ,c a u s i n g f o o d s a f e t y p r o b l e m s .Y e a s t c o n t r o l h a s b e c o m e a n e w s t r a t e g yf o r f r u i t p o s t -h a r v e s t d i s e a s e c o n t r o l a n d m y c o t o x i n d eg r a d a t i o n b e c a u s e i t d o e s n o t p r o d u c eh a r m f u l m e t a b o li t e s a n d i s e n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y .T h i s p a p e r s u m m a r i z e d t h e c o m m o n p a t h og e n i c f u n gi a f t e r h a r v e s t a n d t h e i r i n f e c t i o n c h a r a c t e r i s t i c s t o f r u i t s ,t h e i n -f e c t i o n m e c h a n i s m o f p a t h o g e n i c b a c t e r i a a f t e r h a r v e s t ,a n d t h e b i o l o g i c a l c o n t r o l m e c h a n i s m o f ye a s t .K e yw o r d s :f r u i t ;p o s t h a r v e s t d i s e a s e ;m y c o t o x i n ;a n t a g o n i s t i c y e a s t ;b i o l o g i c a l c o n t r o l 水果中含有丰富的营养成分,定期摄入水果可以预防肥胖㊁心血管㊁眼睛和骨骼等疾病[1]㊂我国是水果消费大国,消费量达到全球总量的60%以上㊂然而,水果在采后容易受到各种致病菌的入侵而引起变质,导致严重亏损[2]㊂其中采后发生病害引起的腐烂损失最严重,据统计,我国每年水果蔬菜因腐烂造成的经济损失占其总产值的30%以上,可达750亿元[3-4]㊂水果采后生理性衰老㊁病害的侵染以及外界环境因素的共同作用,引起了水果的腐烂变质㊂引起水果采后病害的病原菌主要为真菌[4]㊂这些真菌包括青霉属(P e n i c i i i i u m s p p .)㊁灰葡萄属(B o t r yt i s c i n e r e a )㊁交链孢霉属(A l t e r n a r i a s p p .)㊁曲霉属曲霉(A s p e r g i l l u s s p p .)和毛霉属(M u c o r s p p .)等㊂这些病原真菌能够在较低的温度条件下正常生长并产孢,它们繁殖速度快,对环境的适应能力强,因而可迅速侵染果实㊂这些病原真菌主要从果实的伤口部位或皮孔处入侵,引起伤口周围软化和水溃化,并长出菌丝形成霉斑,霉斑往往会分泌大量分生孢子,引起果实溃烂并发出腐败气味[5]㊂这些致病菌不仅导致果实腐烂,而且常常会分泌一些次生代谢产物如展青霉素,黄曲霉素,赭曲霉毒素等,对于人体产生较大的危害作用[6]㊂试验表明,这些毒素有些具有致癌㊁致突变和免疫等负面作用,有些是神经毒素可引起恶心㊁呕吐㊁便血㊁惊厥等㊂目前用于防治水果采后病害的方法主要包括化学防治㊁物理防治和生物防治㊂物理方法包括低温贮藏㊁热处理㊁辐照处理等㊂物理方法成本较高,实施难度较大,受设备条件限制较多㊂化37Copyright ©博看网. All Rights Reserved.学防治法是使用化学杀菌剂来进行防治[7],常见的化学杀虫剂有双胍盐㊁抑霉唑㊁苯菌灵等㊂这些化学杀菌剂不易分解,其在果实表面残留问题会带来食品安全隐患[8],同时,化学药剂常常会导致病原菌产生抗性,降低防治效果[9]㊂生物防治的方法是通过生防菌㊁病原菌以及环境之间相互影响,改善微环境,达到防病的目的㊂生物防治的方法也被认为是最有可能替代化学杀菌剂的方法之一[10]㊂迄今为止,人们已经筛选鉴定出许多有效的拮抗菌株[11],其中包括细菌(P s e u d o m o n a s s p p, B u r k h o l d e r i a s p p.等)㊁小型丝状真菌(T r i c h o d e r-m a s p p.,A s P e r g i l l u s s p p.等)和酵母菌(A u r e o-b a s i c h i u m s p p.,K l o e c k e r a s p p.,M e t s c h n i k o w i a s p p.,R h o d o t o r u l a s p p.)等㊂H a s s a n等[12]发现生防菌沙福芽孢杆菌(B a c i l l u s s a f e n s i s)B3可以通过水解病原菌的细胞壁,来抑制草莓采后灰霉病的发生㊂L u[13]从土壤中分离到洋葱伯克霍尔德氏菌(B u r k h o l d e r i a c o n t a m i n a n s)M S14,该菌对多种植物病原真菌表现了广泛的杀灭作用,可以抑制黑曲霉(A s p e r g i l l u s n i g e r)㊁青霉菌(P e n i c i l l i u m s p.)㊁互隔交链孢菌(A l t e r n a r i a a l t e r n a t a)㊁立枯丝核菌(R h i z o c t o n i a s o l a n i)等多种病原菌的生长,而且可使真菌的细胞内部和细胞形态发生畸变㊂在拮抗菌中,拮抗酵母由于对环境和人体健康友好,一般不产生抗菌素,成为了采后生物防治领域的一大亮点[14]㊂关于拮抗酵母应用于果蔬釆后保鲜的报道也较多㊂张奇儒等[15]从土壤中发现1株对梨果青霉病有防治效果的异常威克汉姆酵母(W i c k e r h a m o m y c e s a n o m a l u s),经检测证实该菌株无毒性,在浓度为1ˑ108个/m L时生防效果显著;王淑培[16]发现桔梅奇酵母(M e t s c h n i k o w i a c i t r i e n-s i s)能在果实伤口处快速定殖,形成生物膜,不仅能有效控制橘采后酸腐病,还能显著抑制柑橘白地霉(G e o t r i c h u m c i t r i-a u r a n t i i)孢子萌发及菌丝生长㊂1水果采后主要致病菌及其毒素1.1扩展青霉扩展青霉(P e n i c i l l i u m e x p a n s u m)可引起苹果㊁梨㊁葡萄等果实采后青霉病[8]㊂该菌属子囊菌门(a s c o m y c o t a)散囊菌纲(E u r o t i o m y c e t e s)青霉属(P e n i c i l l i u m)[17]㊂果实主要在成熟时期容易受到其侵染,发病后病斑呈褐色圆形状,会使果实变软烂并逐渐从发病处扩散[4],在适宜环境下,8d左右便会完全腐烂㊂在温度和湿度较高的情况下,病斑处会出现霉块,初期为白色,后面逐渐变为青绿色,并伴有浓烈的腐烂味㊂菌落草绿色,小斑点状,中央一般呈凸起状,背面黄褐或肉桂色,菌丝无色透明,聚集时常呈白色,分子孢子梗呈不对称帚状分枝,且表面光滑,呈淡青绿色,一般近圆形或圆形,孢子大小为(1.8~2.2)μmˑ(1.8~2.2)μm[18]㊂扩展青霉分泌的毒素为展青霉素(P A T),又名棒曲霉素㊁珊瑚青霉素㊂该毒素还可由棒形青霉(P.c l a v i-f o r m e)㊁粒状青霉(P.g r a n u l a t u m)㊁产黄青霉(P.c h r y s o g e n u m)和曲霉属的棒曲霉(A.c l a v a l u s)等分泌[19]㊂展青霉素对胃具有刺激作用,可从口腔进入消化系统并入侵至肠道,还可引起肠炎㊁胃溃疡和上皮细胞恶化等疾病,当胃肠道黏膜受损,毒素可随着血液在人体内循环,引起免疫系统受损[20]㊂展青霉素分子的内酯结构和半缩醛结构是引起其毒性的主要机制,因此这些结构的消失被认为是解毒的标志[21]㊂展青霉素具有强的亲水性和稳定性,容易通过食物和饮用水积累在人体内[22]㊂1.2灰葡萄孢霉灰葡萄孢霉(B o t r y t i s c i n e r e a)属子囊菌门(a s-c o m y c o t a)锤舌菌纲(L e o t i o m y c e t e s)核盘菌科(S c l e r o t i n i a c e a e),可侵染葡萄㊁番茄㊁梨㊁桃㊁草莓等多种果蔬,引发灰霉腐烂病[23],该菌对低温有很好的适应性㊂果实发病初期病斑为水浸状,淡褐色,后病斑颜色逐渐加深,环境湿度大时可产生深灰色霉状菌丝㊂灰葡萄孢霉不仅可侵染果实,还可侵染植株,慈志娟等[24]研究表明灰葡萄孢霉可以在草莓生长期间侵染其叶片,叶柄,花瓣等部位,首先会从衰老受损部分开始入侵,感染后果实的颜色变为浅褐色或果肉坏死腐烂,病斑处出现灰色霉菌㊂灰葡萄孢霉不同的菌株常常致病性差异较大,K e r s s i e s 等[25]对30株具有不同致病性的灰葡萄孢霉进行随机扩增多态性D N A分析,发现菌株的侵染能力㊁采样时间㊁地点和R A P D模式之间并无关联㊂二环倍半萜烯(B o t r y d i a l)是灰葡萄孢霉产生的最主要的毒性,其毒性也最强,其他毒素大部分为其前体或衍生物㊂研究发现B o t r y d i a l并不会由植物本身分泌,而是植物组织被感染后产生,且宿主越衰败,B o t r y d i a l含量越高,因此灰葡萄孢霉主要通过该毒素致病[26]㊂1.3链格孢霉链格孢霉菌(A l t e r n a r i a s p p.)又称脉孢霉,属于半知菌亚门(D e u t e r o m y c o t i n a)丝孢纲(H y p h o-m y c e t e s)暗色孢科(D e m a t i a c e a e),易在低温环境下47果树资源学报2023,4(4)Copyright©博看网. All Rights Reserved.生存[27]㊂其菌丝体呈黑色,分生孢子呈倒棒状㊁顶部延长成喙状,有纵横格,多个为链状[28]㊂营养菌丝匍匐生长,菌落整体呈现黑色绒状[29],背部呈深褐色有同心螺纹[30]㊂链格菌不仅能够侵染农作物还能侵染多种果蔬,包括寄生㊁腐生和兼性寄生或腐生[31]㊂在低温避光潮湿的环境下,链格孢霉会产生毒素,这些毒素包括链格孢酚(a l t e r n a r i o l,A O H)㊁细链格孢菌酮酸(t e n u a z o n i c a c i d,T e A)㊁链格孢甲基醚(a l t e r n a r i o l m o n o m e t h y l e t h e r,A M E)㊁细格菌毒素Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ㊁链格孢霉烯(a l t e n u e n e,A L T)[32]㊂它们具有基因毒性㊁细胞毒性㊁和致突变性[33]㊂根据其结构可分为5大类:二萘嵌苯及其衍生物㊁二苯并吡喃酮类及其衍生物㊁细交链格孢菌酮酸及其衍生物㊁丙三羧酸酯类化合物和混杂结构[34]㊂1.4黑曲霉菌黑曲霉菌(A s p e r g i l l u s n i g e r)属于半知菌类亚门(D e u t e r o m y c o t i n a)丝孢纲(H y p h o m y c e t e s)曲霉属(A s p e r g i l l u s)㊂分生孢子梗为球形顶囊,分生孢子直径约2.5~4.0μm㊂菌落由白色经黄色后变为黑色,厚绒状[35]㊂黑曲霉侵染果实后,会使果实腐烂皱缩,糖和酚类等营养物质流失,最终严重影响果实口感[36]㊂黑曲霉菌会产生赭曲霉毒素㊁黄曲霉毒素㊁奥卡那胺和阿库雷星等类似物,能损伤人体器官,同时还具有致癌等不良影响㊂且毒素不会高温灭活,稳定性较高[36]㊂1.5毛霉菌毛霉(m u c o r)又名白霉,属于接合菌亚门(Z y-g o m y c o t i n a)接合菌纲(Z y g o m y c o t i n a)毛霉属(M u-c o r a l e s)[37]㊂是多种果蔬采后病害的病原菌,其无法通过果皮侵染,只能感染果实伤口㊂霉菌菌丝为白色,菌丝体十分发达,有分枝,一般无假根及匍匐菌丝,个别菌种罕见假根㊂在室温下几天就会完全侵染果实,并在较短时间内侵染健康果实,侵染后果实腐烂软塌,内部汁液化较重㊂毛霉在6ħ以后生长繁殖会受到抑制[38]㊂毛霉菌会引发毛霉病,是一种深部真菌病,其广泛存在于自然界中,为土壤㊁植物㊁面包㊁水果㊁粮食等的常见腐生菌和空气中的气生菌㊂主要通过空气孢子吸入感染㊂2果实采后致病菌的侵染机理2.1分泌细胞壁降解酶细胞壁是致病菌入侵的首道防线㊂致病菌侵入植物时通过释放各种酶来降解蛋白质㊁多糖以及芳香族聚合物,使植物的细胞壁产生破裂,以此来降低植物的防御功能[39]㊂卢晶晶等[40]研究发现,病原菌释放各种酶类来使病原菌成功入侵宿主,同时酶降解产物可以促进致病菌生长,这一结论也在基因方面得到验证,如切除果胶裂解酶基因C c p e l A可以使炭疽病菌侵染绿色番茄果实的能力下降[41]㊂2.2分泌毒素致病菌分泌的毒素也能使果实发病㊂毒素会影响原有胞内构造,破坏膜通透性和果实防御系统,以此来降低果实抗性,干扰果实生理代谢,使宿主病变或衰亡[42]㊂比如,烟曲霉分泌的二羟基萘(D i-h y d r o x y n a p h t a l e n e,D H N)-黑色素能通过破坏宿主防御系统来增强其致病能力[43]㊂灰葡萄孢霉主要通过B o t r y d i a l毒素致病,使宿主细胞结构发生变化,引发宿主软腐,组织坏死[26]㊂马铃薯立枯丝核菌产生的毒素可使马铃薯幼苗细胞膜透性增加,电解质外渗[44]㊂莲子草假隔链格胞毒素可作用于空心莲子草细胞叶绿体基粒片层,使叶绿体基粒片层肿胀甚至发生紊乱[45]㊂2.3分泌辅助因子致病菌入侵果实时,果实通过激发自身的先天免疫系统来进行防御㊂一方面,果实可以识别致病菌的一些分子,然后通过信号传导来激活相关的分子模式(P A M P)触发免疫反应(P T I)[46]㊂另一方面,当致病菌入侵时会分泌一些效应因子来抑制宿主的防御[46]㊂比如,核盘菌可以分泌草酸降低宿主的p H,以确保其细胞壁降解酶P G等的活性表达,同时宿主抗病相关酶活性降低,加速入侵㊂此外,草酸还可与植物细胞壁的C a2+螯合,而C a2+可以参与信号传导和防御反应,从而阻碍宿主正常代谢㊂而螯合的产物草酸钙,可形成堵塞导管和维管束的晶体,宿主的水分代谢也受影响,从而加速发病[47]㊂2.4p H调节致病菌在入侵宿主过程中,会分泌一些酸碱物质来调整p H,以此来增强致病菌入侵能力,确保完成入侵[48]㊂比如,扩展青霉和指状青霉等产酸菌在入侵苹果时分泌葡萄糖酸和柠檬酸等有机酸改变环境p H,在适宜p H条件下会促进霉菌毒素和果胶酶的产生和表达[49-50]㊂互隔交链孢(A l t e n a r i a a l t e r-n a t a)通过分泌氨类物质将p H值由酸性转变为碱性,会使纤维素酶关键基因A a K l激活,加速了A.57蔺楠,等:水果采后致病菌及拮抗酵母防治机制研究进展Copyright©博看网. All Rights Reserved.a l t e r n a t a对在柿子体内的入侵[51]㊂3拮抗酵母的生防机制3.1营养和空间竞争拮抗酵母常以二糖和单糖的碳水化合物和氮源为养料[52],大量繁殖后在伤口处聚集形成生物膜,空间上阻断了致病菌的侵染[7,53]㊂K l e i n等[54]发现在培养基中加入0.5%蔗糖和1%硫酸铵有利于酵母菌生长,可刺激生物膜产生,提高对柑桔酸腐病的抑制效力㊂此外,酵母中抑制性化合物的合成通过原位或非原位吸收营养物质而增加,提高了它们对植物病害的生物防治能力㊂如李侨飞[55]等发现拟粉红锁掷孢酵母Y16(S p o r i d i o b o l u s p a r a r o s e u s)能在短时间内快速生长繁殖,以此来构成一个完整的菌膜,阻隔致病菌入侵,抑制葡萄黑曲霉(A s p e r-g i l l u s n i g e r)的生长㊂田亚琴[56]发现将葡萄糖作为外源营养物质加到伤口处时,与单独加美极梅奇酵母相比抑制率更高,且越早接种效果越好㊂3.2杀手毒素杀手毒素通常是由不同品种的酵母产生的糖基化蛋白质,可以破坏特定的细胞壁成分,包括β-1, 3-d-葡聚糖,β-1,6-d-葡聚糖,甘露蛋白和几丁质等,从而导致病原真菌细胞死亡[57]㊂所有毒素都是在酸性条件下产生的,它们的活性在一定范围内随着培养基的p H和温度的增加而降低[58]㊂杀手毒素附着在细胞膜上,在细胞膜上它们与导致细胞变化的次级受体相互作用㊁D N A合成抑制㊁细胞周期破坏和R N A片段化[59]㊂如膜醭毕赤酵母(P i c h i a m e m b r a n i f a c i e n s)可以产生两种杀手毒素P M K T1和P M K T2,这两种毒素对腐败酵母和病原菌均有杀伤作用㊂3.3溶解酶酵母可以通过产生葡聚糖酶㊁几丁质酶和蛋白酶等溶解酶对病原菌产生拮抗作用,其能够将致病菌细胞壁分解,破坏其结构,导致细胞溶解和死亡[60]㊂田亚琴[56]发现在特殊培养基上接种美极梅奇酵母(M e t s c h n i k o w i a p u l c h e r r i m a)后,该酵母能够分泌胞外几丁质酶和胞外葡聚糖酶㊂李侨飞[55]试验表明拟粉红锁掷孢酵母Y16(S.p a r a r o s e u s)能降解青霉菌的几丁质成分,会使霉菌菌丝发生坏死并抑制霉菌生长繁殖㊂杨其亚[61]发现胶红酵母(R h o d o t o r u l a m u c i l a g i n o s a)能提高β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,从而延缓苹果青霉病㊂3.4诱导宿主抗性酵母细胞壁的一些物质可以诱导宿主产生抗性,加速果实伤口愈合过程,从而达到生防作用[62]㊂美极梅奇酵母(M.p u l c h e r r i m a)可以诱导苹果果实中的细胞壁相关酶类,并能够提高芒果P P O㊁P O D活性,降低了芒果炭疽病的发病率[63]㊂试验表明,将膜醭毕赤酵母(P.m e m b r a n i f a c i e n s)接种于桃果实时,可以使果实产生多种抗性蛋白酶,这些酶可以使果实由于氧化造成的伤害得到缓解,延缓果实腐烂[64]㊂诱导寄主抗性的两种基本形式包括系统获得性抗性(S A R)和系统诱导抗性(I S R)[65]㊂S A R是多种病程相关蛋白(P R)共同作用的结果,拮抗酵母作为一种生物刺激因子,可以激发果实中多种病程相关蛋白的表达,从而增强果实对病害的抗性㊂如梅奇酵母属(M e t s c h n i k o w i a s p.)可以有效控制采后柠檬的蓝色和绿色青霉病,而且酵母菌的浓度越高,柠檬的腐烂率和病斑直径就越低,同时能够显著提高柠檬果实中抗病相关酶几丁质酶(C H T)㊁苯丙氨酸解氨酶(P A L)和过氧化氢酶(C A T)的活性[66]㊂红东孢酵母(R h o d o s p o r i d i u m k r a t o c h v i l o v a e)可以增强果实病程中蛋白基因的表达,提高梨果体内多种防御酶活性,同时果实发病率也降低[67]㊂3.5挥发性代谢物质近年来,国内外许多研究表明,拮抗菌产生的挥发性物质可以用于防治果实病害[68]㊂由于挥发性物质分子小㊁易挥发扩散,杀菌范围广等优点得到广泛应用[69]㊂如郭虹娜等[70]发现有孢汉逊酵母(H a n s e n i a s p o r a u v a r u m)挥发代谢物的主要抑菌成分是桂皮醛,并通过研究发现使用62.5μL/L的桂皮醛对草莓进行熏蒸处理能有效保持草莓品质,延缓品质下降,对草莓采后灰霉病抑制效果明显,能抑制贮藏期间草莓M D A含量的升高,有效诱导草莓C A T㊁P P O㊁A P X相关抗性酶活,延缓S O D酶活的下降,对草莓相关抗性基因表达的影响与上述酶活类似㊂陈莹莹等[71]研究发现膜醭毕赤酵母(P. m e m b r a n i f a c i e n s)产生的挥发性物质可以有效抑制灰葡萄孢菌,且熏蒸第2天就抑菌率超过70%,同时验证了挥发性物质可破坏菌丝细胞膜使细胞内容物大量外泄,同时分生孢子数量也大大减少㊂3.6活性氧作用植物遭受致病菌胁迫时,首先会诱导产生活性氧(R O S),包括超氧阴离子(S u p e r o x i d e a n i o n,O2-)67果树资源学报2023,4(4)Copyright©博看网. All Rights Reserved.和过氧化氢(C h y d r o g e n p e r o x i d e,H2O2)㊂超氧化物歧化酶(S O D)可以催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2,并且在F e2+或C u2+离子存在下, H2O2通过F e n t o n反应进一步转化为㊃O H自由基[72],从而达到清除O2-的目的㊂活性氧的清除包括酶促反应和非酶促反应,其中酶促反应包括过氧化物酶(P O D)和抗坏血酸过氧化物酶(A P X)等,而非酶途经包括植物自身含有的的抗氧化物质如谷胱甘肽(G S H)和谷胱甘肽还原酶(G R)等㊂C a s t o r i a 等[73]发现罗伦隐球酵母(C.l a u r e n t i i)对果实病害的抑制能力与其对R O S的耐受能力呈正相关,也说明了氧化应激反应在生防机制中的作用㊂M a c a r i-s i n D[74]研究发现将两种拮抗酵母(梅奇酵母和丝酵母)接种于不含营养的培养基或苹果表面(置于无营养空间),会产生大量超氧阴离子,而接种于果实伤口处则导致果实组织中产生大量H2O2,在伤口处收集的酵母中也会含有许多H2O2,说明R O S是酵母提高其拮抗能力的其中一个原因㊂4结论这些病原菌入侵果实后会分泌细胞壁降解酶,毒素,辅助因子以及改变p H来使水果腐烂变质㊂同时拮抗酵母可以通过竞争空间和营养,分泌溶解酶,杀手毒素,诱导宿主抗性等方式来抵御致病菌,以维持果实正常品质并保障食品安全㊂拮抗酵母具有来源广泛㊁适应性强㊁繁殖能力强㊁代谢产物无毒且无致敏性的特点,逐步应用于有害微生物的防控领域㊂未来可继续从体内外两个方向筛选种类更多,效果更强的拮抗酵母菌株,并进行食品安全验证㊂同时对酵母菌在分子水平上的代谢机制进行深入的研究分析,系统性地总结和归纳拮抗酵母在分子水平上的最新研究进展,进一步研究拮抗酵母的拮抗机制并为基因工程改性高活性拮抗酵母提供科学参考㊂参考文献[1] V A L C K E M,B O U R G A U L T M H,R O C H E T T E L,e ta l.H u m a n h e a l t h r i s k a s s e s s m e n t o n t h e c o n s u m p t i o no f f r u i t s a n d v e g e t a b l e s c o n t a i n i n g r e s i d u a l p e s t i c i d e s:A c a n c e r a n d n o n-c a n c e r r i s k/b e n e f i t p e r s p e c t i v e[J].E n v i r o n m e n t i n t e r n a t i o n a l,2017,108:63-74.[2] G R A M I S C I B R,L U T Z M C,L O P E S C A,e t a l.E n-h a n c i n g t h e e f f i c a c y o f y e a s t b i o c o n t r o l a g e n t s a g a i n s tp o s t h a r v e s t p a t h o g e n s t h r o u g h n u t r i e n t p r o f i l i n g a n dt h e u s e o f o t h e r a d d i t i v e s[J].B i o l o g i c a l C o n t r o l,2018,121:151-158.[3]张红印,蒋益虹,郑晓冬,等.酵母菌对果蔬采后病害防治的研究进展[J].农业工程学报,2003,19(4):23-27.[4]罗杨.膜醭毕赤酵母对柑橘采后青绿霉病害的生物防治及机理研究[D].西南大学,2011.[5]卞文怡.微胶囊化水杨酸对苹果采后青霉病的诱导抗病研究[D].上海应用技术大学,2019.[6]王利平,王丽霞,刘保友,等.苹果及其制品中展青霉素研究进展[J].落叶果树,2022(54):39-43. 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中国部分Botryosphaeriaceae真菌的系统发育及模式种Botryosphaeria dothidea的遗传多样性研究葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）（子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes）真菌分布广泛，种类繁多，寄主类型多样，在我国引起多种重要的经济树木枝条或主干发生溃疡病，包括杨树和多种果树等。

长期以来病原真菌的命名多根据病害和寄主来命名，造成了同菌异名、同名异菌的问题，引起了该科真菌的命名和分类混乱的问题。

该属模式种Botryosphaeria dothidea是该科最常见的种之一，是引起树木溃疡病最重要的病原，在我国多个气候区均有发生，阐明该种不同地理群体间的遗传多样性和遗传分化，对病害的检测和防治具有重要意义。

为了澄清我国树木溃疡病病原真菌的种类和调查葡萄座腔菌科真菌在我国分布的多样性，针对引起杨树和蔷薇科果树病害的葡萄座腔菌科病原进行研究，采用形态学和系统发育学的方法，从我国南北方的5个典型气候区分离到58株寄主为杨树和37株寄主为蔷薇科果树的试验菌株，结合形态学和系统发育分析方法，鉴定葡萄座腔菌科5个属8（或9）种真菌。

Botryosphaeria dothidea种群具有中度偏高的遗传多样性，Nei’s基因多样性指数（H）为0.6777。

利用形态学结合ITS、β-tubulin和EF1-α序列比较分析表明，发生于杨树上的种类包括Botryosphaeria dothidea、Neofusicoccum parvum、Diplodia seriata、D. mutila、Dothiorellaviticola和一个未定名新种Fusicoccum sp.1，其中，共有53株为B. dothidea，其它种各1株；发生于蔷薇科果树上的有B. dothidea、Lasiodiplodia pseudotheobromae、Neof.parvum/Neof. ribis复合种和另一个未定名新种Fusicoccum sp.2，其中，B. dothidea15株，L. pseudotheobromae和Neof. parvum/Neof. ribis各有3株， Fusicoccum sp.2有6株。

响应面法优化葡萄微嫁接组培快繁体系李雪雪;郭雯岩;周璇;赵伟;牛铁泉;纪薇【摘要】为提高鲜食葡萄苗木品质和良种繁育速度,以鲜食葡萄品种晶红宝为试验材料,探究培养基天然营养添加物的种类及浓度、外植体消毒时间、光周期、微嫁接方法和绑缚材料等因素对葡萄微嫁接苗成活率的影响,结合响应面法确定葡萄微嫁接苗组培最佳试验条件,优化葡萄微嫁接组培快繁体系.结果表明,MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂培养基(pH 5.8～6.0)中添加香蕉泥可显著降低微嫁接苗的褐变率和污染率,促进不定根的伸长.响应面分析进一步确定了葡萄微嫁接组培的最佳试验条件为氯化汞消毒7.1 min,光照17 h,香蕉泥浓度700 mg/L.在此基础上采用劈接法、锡箔纸作绑缚材料的葡萄微嫁接苗成活率显著高于其他处理.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2019(058)009【总页数】6页(P69-74)【关键词】葡萄;组织培养;微嫁接;响应面分析【作者】李雪雪;郭雯岩;周璇;赵伟;牛铁泉;纪薇【作者单位】山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031;山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031;山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031;山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031;山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031;山西农业大学园艺学院,山西太谷 030801;果树种质创制和利用山西省重点试验室,太原 030031;农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,太原 030031【正文语种】中文【中图分类】S663.1中国是葡萄（Vitis spp.）生产大国，截至2018年底葡萄产量已达845.0万t ［1］。

葡萄穗霉属真菌次级代谢产物及生物活性研究李博;刘东;季宇彬【摘要】Stachybotrys fungi are widely distributed , including Stachybotrys complementi , Stachybotrys kampalensi , Stachybotrys atra and soon .Stachybotrys can produce a variety of toxins .Stachybotrys have serisous impact on human health and life , extensive attention were paid from the scientific community .In this paper , the secondary metabolites and biological activities of Stachybotrys fungi were reviewed .%葡萄穗霉（ Stachybotrys ）属真菌分布广泛，包括了以黑葡萄穗霉（ Stachybotrys chartarum ）为代表的Stachybotrys complementi ，Stachybotrys kampalensi ，Stachybotrys atra 等多个种。

葡萄穗霉能产生多种毒素，严重影响人类的健康和生活，因而受到了科学界广泛关注。

综述了葡萄穗霉属真菌所产生的次级代谢产物以及生物活性。

【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】7页(P385-391)【关键词】葡萄穗霉;次级代谢产物;生物活性【作者】李博;刘东;季宇彬【作者单位】哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076; 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076;北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京100191;哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076; 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076【正文语种】中文【中图分类】R284葡萄穗霉属于腐生真菌，能代谢多种毒素，给人类的生活和健康造成很严重的影响.20世纪30年代，前苏联和东欧部分国家报道有许多匹马食用饲料后突然死亡，后来证实为黑葡萄穗霉代谢的毒素所致[1].1940年首次发现了该属真菌对人类造成的影响—人感染穗霉菌中毒症(stachybotryotoxicosis)，症状包括有发炎、高烧、干咳、头晕目眩、浑身乏力等[2].在1979年有大批的绵羊在南非共和国死亡，最后确定其原因同样为饲料中含有葡萄穗霉产生的单端孢霉烯类毒素[3].基于上述事件，葡萄穗霉引起了人们广泛关注，世界各国逐渐开展了对该属真菌的化学成分及毒性研究，并从中发现了结构类型多样、并具有显著毒性或其他生物活性的化学物质.本文对葡萄穗霉属真菌次级代谢产物的分子多样性及生物活性进行综述.1 次级代谢物与活性1.1 混源萜类化合物如图1所示，K-76(化合物1)是1979年Kaise等人首先从葡萄穗霉Stachybotrys complementi 中将苔藓酸倍半萜衍生物分离得到，这类化合物的结构具有倍半萜骨架折叠成补身烷型并且醛基取代苔藓酸苯环的1位和6位的特点，免疫抑制和蛋白酶抑制在这类化合物中具有明显的活性[4-6].化合物1芳香环以及倍半萜环上的取代基发生氧化还原修饰则得到一系列类似的苯-补身烷型倍半萜衍生物1～5，其中化合物1通过X-RAY分析得到确定化合物的绝对构型[4].倍半萜衍生物化合物1～5苯环上邻二取代较不稳定，常常发生环化反应，一个N或O杂原子被在反应过程中引入，五元内酰胺，五元内酯或缩酮的结构被形成.上述成杂环化反应后的产物以倍半萜衍生物化合物1～46为代表.其中倍半萜衍生物化合物1～18具有免疫抑制的活性这是通过对抗补体而发挥出来的[7].而倍半萜衍生物化合物35～41在抗病毒活性中表现出很好的药理活性[8-9].其中，化合物35的抗H1N1活性尤为突出.内酰胺环上的N氢被各种碳链所取代则得到一系列相应的叔氨衍生物.酰胺氮氢被羧酸取代，得到倍半萜衍生物化合物20～21，31～33，42～46.活性研究证明倍半萜衍生物化合物20～32具有良好的内皮素受体拮抗作用[10]，倍半萜衍生物化合物42-46是很好的酪氨酸激酶Tie家族抑制剂[11]，倍半萜衍生物化合物17～23具有良好的胆固醇酯酶抑制剂，在浓度6×10-5～1.1×10-1 mol/L可减少胆固醇吸收50%～60%[12]，staplabins 47～49具有纤维蛋白酶原激活作用[13-14].倍半萜衍生物化合物50是由两个拟对称结构组成的二聚体，具有很好的抗HIV蛋白酶活性[15-16].抗HIV活性的测定：以化合物24为例，可以将该类化合物取10 μmol/L，进行抗HIV的活性检测.分别用NRTIAZT，MK0518 和NNRTI EFV混合11.59、17.78、13.06 h.TOA的检测结果显示其可能有一定的抗HIV的活性.于是，将化合物24进行有针对性的抗HIV的活性检测.用一个很重要的生物活性的检测NNRTI做活性筛选，发现其在五个NNRTI上有很好的抗HIV的作用.EC50在0.7～2.8之间.这与K-76这个化合物活性检测是相似的[17].图1 混源萜补身烷型化合物1.2 蛋白质类穗霉菌蛋白酶A (sStachyrase A)是一种蛋白酶，它与糜蛋白酶类似，MW为32 000，属丝氨酸蛋白酶类，主要作用于疏水性氨基酸残基，可分解几种生物活性肽和胶原以及主要的蛋白酶抑制因子[18].研究表明，穗霉菌溶血素是导致中毒动物和人肺出血的原因之一[19].穗霉菌溶血素(stachylysin):MW11 920，疏水氨基酸占整个分子质量的40%，同时其含有二个半胱氨酸残基，多以三聚体、五聚体形式存在，但其活性形式目前仍不清楚.按细菌命名法，该溶血素属β溶血素[20].Gregory等采用免疫细胞化学方法证明了毒素是由孢子扩散出去的，确定了穗霉菌溶血素在孢子内壁及周围浓度最高，距离越远浓度越低[21].1.3 倍半萜衍生物从Stachybotrys kampalensi.中分离得到的Kampanol A-C (51-54) [22]如图2所示，是一种可能的新型的抗癌剂，该类型化合物是FPTase蛋白转移酶的专一抑制剂.图2 倍半萜类化合物1.4 大环单端孢霉烯族化合物单端孢霉烯族化合物(Trichothecenes)是一类真菌毒素，其基本结构是倍半萜，因其12～13位环氧结构又将其称为12，13环氧单端孢霉烯族化合物.包括葡萄穗霉属(Stachybotrys)，刺黑乌霉属(Memnoniella)，镰刀菌属(Fusarium)，单端孢霉属(Trichcthecium)，木霉属(Trichodern)，漆斑菌属(Myrothecium)等真菌能够产生这类化合物.这类化合物的生物活性随着结构的变化而变化，从免疫抑制活性、抗真菌活性(抗生素)、抗癌活性、植物性毒素活性、细胞毒素的活性、抗白血病活性、抗病毒活性直到杀虫活性[23].其中细胞毒性在大多数单端孢霉烯类化合物普遍存在，同时其对于原核细胞、真核细胞、肿瘤细胞均具有明显的毒性，它们的毒性机制主要包括：抑制蛋白质的合成(特别是真核生物)[24]；抑制DNA的合成[25]；抑制线粒体电子传递系统[26-27].12，13-位具有环氧结构的该类化合物还具有其他特殊生物活性，如抗增殖作用[28]、诱导细抱凋亡作用[29] 、抗疟活动[30] 、以及抗病毒作用[31].1975年，M·Eppley和Eugene·P发现了该菌Stachybotrys atra分泌的高毒力物质主要是大环单端孢霉烯，尤其是高毒力的satratoxin H(61)[32].随后1995年Bruce B等人从该菌中分离得到一系列的大环单端孢霉烯类化合物55～69[27]，如图3所示.satratoxin G主要分布在孢子外质膜和内壁层是由Gregory等采用免疫细胞化学方法确定的，它在菌丝中含量较少，说明satratoxin G在孢子中浓度最高，是一种结构性物质[33].Satratoxins是水溶性的而不是结合在多糖等水溶性物质上是由Karunasena等研究的结果所确定的.图3 大环单端孢霉烯族化合物1.5 二萜类化合物1999年，Hinkley等人从Stachybotrys atra中发现一系列新的二萜结构(70-77)，如图4所示.该类结构中以烯醇内酯环，3,7-二氧双杂环为特征[34-35].目前，这类化合物的药理活性还不是很清楚.图4 二萜类化合物2 结语综上所述，葡萄穗霉属真菌中存在大量结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，为分子生物学和天然药物化学的有机结合提供了新的思路和方向.有潜力成为发现新药先导化合物的重要微生物资源，有待于人们进一步的发掘与利用.同时也表明了，人们可以继续丰富这株菌的次级代谢产物，寻找到更加新颖的骨架化合物以及具有更好生物活性的化合物.为新药的开发提供更多的资源和价值.参考文献：[1] VESPER S J, DEARBORN D G, ELIDEMIR O, et al. 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葡萄附生菌群中致腐菌拮抗酵母的筛选及初步鉴定程雅芳，杨梦昕，朱秋雨，覃兴熹，檀倩影*（广西卫生职业技术学院，广西南宁 530023）摘　要：本文分别从葡萄根系土壤、果实和叶片中筛选酵母菌株，模拟葡萄贮藏环境设计筛选培养基，得到一株分别对葡萄灰霉病和白腐病致病菌都有拮抗作用的酵母菌株Z2-12。

菌株对两种致病菌的抑制率分别是53.07%和68.28%，同时在果实实体实验中表现出明显的拮抗效果。

经初步检测，Z2-12菌株为酿酒酵母。

关键词：葡萄；酵母；病原微生物；拮抗作用Screening and Preliminary Identification of Antagonistic Yeast Against Pathogenic Microorganisms In Grape Epiphytic Flora CHENG Yafang, YANG Mengxin, ZHU Qiuyu, QIN Xingxi, TAN Qianying*(Guangxi Medical College, Nanning 530023, China)Abstract: In this study, yeast strains were screened from grape root soil, grapes and leaves. A screening medium was designed to simulate grape storage environment, and the Z2-12 was screened, which had antagonistic effects on both grape gray mould and grapevine white rot. The inhibition rates of the strain against the two pathogens were 53.07% and 68.28%, showed significant antagonistic effect in fruit body test. The Z2-12 was identified as Saccharomyces cerevisiae.Keywords: grape; yeast; pathogenic microorganism; antagonistic action葡萄是广西重要的经济型水果，2021年广西壮族自治区葡萄的栽种面积已经超过313 km2，产值超84亿元。

葡萄霜霉病拮抗细菌N6的分离、筛选及鉴定郭继平;马光;朱会霞;刘长远;傅俊范【摘要】筛选葡萄霜霉病菌的拮抗菌株,为该病害的生物防治提供更多的资源.采用稀释平板分离法,从3个品种的健康葡萄叶片上分离得到细菌153株.初筛采用平板对峙法,得到5株拮抗辣椒疫病菌的菌株.采用叶盘法进行复筛,得到防治葡萄霜霉病效果好并且稳定的菌株N6,其防效达到74.2％.通过对菌株N6的形态、生长特性、生理生化反应、16S rDNA序列测定和系统发育分析,鉴定该菌株为砖红微杆菌(Microbacterium testaceum).【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(053)017【总页数】3页(P4063-4065)【关键词】葡萄霜霉病菌菌株;拮抗细菌;分离;筛选;鉴定砖红微杆菌(Microbacterium testaceum)【作者】郭继平;马光;朱会霞;刘长远;傅俊范【作者单位】沈阳农业大学植物保护学院,沈阳110161;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;沈阳农业大学植物保护学院,沈阳110161【正文语种】中文【中图分类】S432.6葡萄霜霉病是一种世界性病害，病原为葡萄生单轴霉（Plasmopara viticala），属鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉菌目霜霉菌科单轴霉属［1］。

该病原是一种专性寄生真菌，菌丝体为无隔、多核菌丝，在寄主细胞间扩展蔓延，以瘤状吸器从寄主细胞内吸取营养。

发病部位产生白色霉霜状霉层，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。

葡萄霜霉病以卵孢子在病组织中或随病叶在土壤中越冬，是病害的初侵染源［2］。

葡萄霜霉病目前的防治手段主要是使用抗性品种［3，4］、改进生产管理技术和化学防治［5，6］。

常年使用化学农药会导致病原菌产生抗药性、环境污染及农药残留等问题。

两个中国野生葡萄抗病相关基因的表达分析葡萄是世界性重要的经济类果树之一，在我国也享有很高的经济地位，目前的栽培面积和产量均位居世界前列。

但是葡萄白粉病等严重影响了葡萄产业的发展,尤其是世界广泛种植的主要的栽培品种欧洲葡萄，果实品质优良但对白粉病抗性较差。

作为世界上最重要的葡萄属植物起源中心之一，我国拥有很多葡萄野生资源，并对白粉病有抗性。

尤其是中国野生华东葡萄由于抗病性强，成为葡萄抗病育种的珍贵资源。

本课题组多年研究发现，中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’对白粉病抗性很强，因此构建了白粉菌诱导的‘白河-35-1’的全长cDNA文库，已经从中克隆了一些与抗病相关的转录因子，并研究其功能。

本研究从该cDNA文库中克隆了一个WRKY转录因子，分析生物和非生物胁迫下的表达模式，并应用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，研究其功能。

中国野生毛葡萄‘丹凤-2’抗白粉病并且果实中白藜芦醇含量高。

白藜芦醇是一种植保素，不仅能够增强植物的抗病性，而且在生物制药方面，发挥了抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病等作用。

由于白藜芦醇是芪合成酶基因的表达产物，因此我们应用实时定量的方法研究了毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的组织特异性表达,以期获得高量表达的中国野生毛葡萄芪合成酶基因。

本研究主要取得以下结果：1.采用RACE技术从白粉菌诱导的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’（Vitispseudoreticulata）全长cDNA文库中分离得到WRKY基因，命名为VpWRKY3（GenbankAccession No.JF500755），全长1280bp,包含960bp开放阅读框，编码319个氨基酸，分子量为35.4kDa。

氨基酸序列同源性比对分析表明，VpWRKY3属于WRKY家族II型a，VpWRKY3含有一个WRKY保守结构域、一个C2-HH型(C-X5-C-X23-H-X1-H)锌指结构域，和两个预测核定位信号RKRK和KKPR。