大鼠肿瘤蛋白p53TP53检测试剂盒

人P53(P53)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T50pg/ml-1600pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中P53（P53）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人P53水平。

用纯化的人P53抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P53，再与HRP标记的P53抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的P53呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人P53浓度。

标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

医院检验中心P53测定操作规程
（1）试剂
1） p53 冻干粉 Cat NO2553 1ml 蒸馏水复溶待用
2）羊抗鼠 IgG(H+L)-FITC Cat NO0279 按说明书复溶，置－ 30 贮存
3）纯甲醇－20℃保存
（2）方法
1）PBS 洗涤细胞，离心后弃上清，用冰甲醇悬浮细胞（边加边摇，以免形成絮状沉淀），冰浴 5 分钟2）2000 转／分离心 5 分钟后弃上清，另 3ml PBS ／ BSA ／ NaN3 洗涤一次
3）PBS ／ BSA ／ NaN3 调整细胞 107 ／ ml
4）吸 100ul 上述细胞悬液到对照管、测定管底部
5）测定管加 10ul p53 单抗，混匀，室温 15 分钟，加 3mlPBS ／ BSA ／ NaN3 洗涤一次
6）在测定管和对照管中加入羊抗鼠荧光单抗（用PBS 1 ： 20 稀释） 30ul ，室温避光 20 分钟，用 PBS ／ BSA ／ NaN3 离心 5 分钟洗涤一次后，再加 0.5 mlPBS ／ BSA ／ NaN3 。

Tp53基因检测什么是Tp53基因？Tp53 基因是一种抑癌基因，定位于人类第17 号染色体的短臂上，编码和表达Tp53 蛋白。

Tp53 基因是细胞生长周期中的调节因子，与细胞周期的调控、DNA 修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能相关联。

Tp53 基因分为野生型（正常的基因）和突变型两种，其产物也有野生型和突变型。

野生型Tp53蛋白可抑制带有DNA 损伤和染色体畸变的细胞发生分裂，从而阻止畸变传递给子细胞，具有广谱的肿瘤抑制作用。

相反Tp53 基因的突变（缺失）则与肿瘤的发生、发展有密切关系。

因此Tp53 被誉为基因卫士。

Tp53检测意义1、应用于肿瘤的超早期预警检测检测范围包括：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等人类多发肿瘤与 p53基因突变有关。

2、应用于肿瘤手术后复发监控肿瘤具有易转移和复发的特点，及早发现复发或转移，可获得二次治疗机会，延长生命。

肿瘤DNA片段存在于血液循环DNA 中，被称细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)。

P53扫描肿瘤组织中存在的突变，p53定期检测cfDNA突变，监控术后复发和评估疗效。

3、放、化疗的疗效评估P53 发现肿瘤特有突变，通过p53定量检测放化疗前后血浆中基因突变含量变化，间接反映肿瘤治疗的效果。

基因小知识：肿瘤的发生和演变过程肿瘤是基因突变累积的结果。

肿瘤的发生和演变过程：从单个细胞开始到形成米粒小的肿瘤，大约需要 8—10年，此阶段人体几乎没有任何症状。

从米粒大小发展成杏仁大小，只需一年左右时间，如果没有及时发现，发展到晚期只需要 3—8 个月的时间。

通过相关突变检测发现肿瘤的早期踪迹，进行合理干预，能够逆转肿瘤的形成。

肿瘤从单细胞基因突变到晚期发展历程图Tp53检测适用人群由于Tp53基因突变主要发生在肿瘤细胞中，因此对于Tp53基因突变的检测主要适用于与癌症相关的人群的检测，主要包括以下几种：（1）癌症高危人群主要包括长期生活在大城市，工作压力大的职业；有癌症家族史或有遗传易感性的人群；长期接触有害化学物质或放射线的人群；有慢性炎症或癌前病变人群以及长期吸烟、饮酒者，过多摄入高脂肪失误导致肥胖者。

tp53结构域-回复TP53是一种关键的肿瘤抑制基因，它在调控细胞周期、细胞凋亡和DNA 修复等过程中发挥重要作用。

TP53蛋白是由一个序列长度为393个氨基酸的多态蛋白质编码的。

该蛋白具有多个结构域，这些结构域对于TP53功能的调控至关重要。

在本文中，我们将一步一步地介绍TP53各个结构域的特性及其功能。

TP53的N-端结构域包括转录激活结构域（Transactivation Domain，TAD）、丰富的随机卷曲结构域（Intrinsically Disordered Region，IDR）和一个富含亮氨酸重复序列的反应元件（negative regulatory element，NRE）。

TAD是TP53蛋白的一部分，它与其他蛋白相互作用，从而调节基因表达。

IDR具有无序的空间结构，它对于蛋白质的功能调节至关重要。

NRE起到负调节的作用，通过与其他蛋白质相互作用来抑制TP53的转录活性。

TP53中的核心结构域是DNA结合结构域（DNA-binding Domain，DBD），它位于TP53的中间部分，包含一个核心结构域和一个DNA结合街区（DNA-binding Loop）。

DBD是TP53功能的关键部分，它负责与DNA结合并启动基因表达的过程。

核心结构域由一个β片段和一个α片段组成，形成了一个结构稳定的锥形蛋白，这种结构域的特异性允许TP53与DNA特定序列结合。

另一个重要的结构域是TET结构域（Tetramerization Domain），位于TP53的C-端。

TET结构域通过四聚体化增加了TP53的稳定性，并调节其功能。

四个TET结构域相互作用形成四聚体，从而促进TP53蛋白的稳定，同时还可以调节其转录活性。

四聚体化状态对TP53蛋白的活性非常重要，因为四聚体的TP53可以更容易地与DNA结合并发挥其调节作用。

除了上述结构域外，TP53还包含一个C端核定位信号（Nuclear Localization Signal，NLS），这个信号用于帮助TP53蛋白进入细胞核。

tp53 指标-回复TP53 是一种编码蛋白质的基因，也被称为肿瘤蛋白53 (tumor protein 53)，或简称为P53。

这是一种关键的调控蛋白质，它在人类体内被归为肿瘤抑制基因。

TP53 基因的突变与许多人类疾病，特别是癌症的发展和进展相关。

本文将深入探讨TP53 指标，介绍它的功能、突变类型、与癌症的关系以及可能的治疗方法。

在开始详细探讨TP53 指标前，首先需要了解TP53 基因的功能和作用。

TP53 基因编码了编序蛋白质P53，它在细胞内扮演着多种角色，以确保细胞的正常生存。

其中最重要的功能是作为一种转录因子，调节其他基因的表达。

P53 被活化后，它可以结合DNA的特定序列，并启动或抑制不同基因的转录，从而调控细胞的生理过程和代谢。

然而，TP53 基因突变导致的P53 蛋白质异常也是相当常见的。

大量的研究表明，TP53 基因的突变与肿瘤的发展相关。

这些突变可以导致P53 失去其功能，从而影响细胞生存的调控。

突变的TP53 基因不仅会导致P53 蛋白质的稳定性降低，还会减弱其调节其他基因的能力。

这种功能损失可能促使异常细胞继续分裂和生长，最终形成癌症。

根据疾病研究和临床观察，不同类型的癌症在TP53 的突变概率上也存在差异。

例如，非小细胞肺癌(NSCLC) 中TP53 的突变频率高达60-70，而乳腺癌中的TP53 突变则相对较低，大约为20-30。

此外，TP53突变还与其他血液病和肿瘤相关，包括结直肠癌、胰腺癌和卵巢癌等。

虽然TP53 突变与癌症的发生和发展密切相关，但它也为我们提供了治疗癌症的潜在靶点。

针对TP53 突变的治疗方法主要包括重新引导P53 功能、增加P53 蛋白质的稳定性以及靶向TP53 突变的药物治疗。

一种常见的治疗策略是通过基因治疗来修复TP53 基因的突变。

这可以通过将正常的TP53 基因导入突变的细胞中来实现。

这可以通过载体介导的基因传递方式，或直接使用克隆的TP53 基因来实现。

7项肿瘤标志物检测试剂盒A【产品名称】通用名称：7项肿瘤标志物检测试剂盒（微阵列化学发光免疫分析法）英文名称：Seven Tumor Markers Test Kit ( Microarray Chemiluminescent Immunoassay)【包装规格】100人份/盒【预期用途】本产品用于体外定量检测人血清样本中的糖链抗原19-9（CA19-9）、糖链抗原125（CA125）、糖链抗原724（CA724）、神经元烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（Cyfra21-1）、胃泌素释放肽前体（Pro-GRP）7种肿瘤标志物的浓度。

【检验原理】本产品由蛋白芯片、酶标二抗反应液、检测液及其他试剂配套组成。

应用双抗体夹心法原理定量检测人血清中的7种肿瘤标志物的浓度。

第一步反应：待测血清与芯片反应，芯片表面的7种肿瘤标志物的单克隆抗体与样品中潜在的相应抗原结合，反应结束芯片经洗涤后进行第二步反应。

第二步反应：将芯片转入预加了酶标二抗反应液的反应杯中，进一步反应形成抗体-抗原-抗体的双抗夹心结构，反应结束芯片经洗涤后检测反应信号。

信号检测：将芯片转移入预加了发光底物的反应杯中，利用致冷CCD对芯片反应区进行成像，读取点阵灰度值。

报告结果：以不同浓度的校准品作为样本进行检测，作出灰度——浓度定量标准曲线，通过该标准曲线计算血清样本中不同指标的相应浓度，报告检测结果。

【适用仪器】江苏三联生物工程有限公司全自动生物芯片阅读仪SLXP-001、SLXP-002。

【储存条件及有效期】2～8 ℃保存，有效期6个月。

【医疗器械注册证编号】国械注准201534002307项肿瘤标志物检测试剂盒B【产品名称】通用名称：7项肿瘤标志物检测试剂盒（微阵列化学发光免疫分析法）英文名称：Seven Tumor Markers Test Kit ( Microarray Chemiluminescent Immunoassay)【包装规格】100人份/盒【预期用途】本产品用于体外定量检测人血清中的糖链抗原19-9（CA19-9）、糖链抗原125（CA125）、糖链抗原724（CA724）、癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（Cyfra21-1）、胃蛋白酶原I（PG I）以及胃蛋白酶原II（PG II）7种肿瘤标志物的浓度。

∗基金项目:北京市自然科学基金资助项目(编号:7192084);首都卫生发展科研专项(编号:2020-2-1152);北京市属医学研究所公益发展改革试点项目(就医研2021-10)作者单位:100069北京市首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所第一作者:霍云飞,男,23岁,硕士研究生㊂E-mail:yunfeihuo@ 共同第一作者:寇卜心,女,32岁,大学本科,检验技师㊂E-mail:koubuxin@通讯作者:石英,E-mail:yingshi@ ㊃实验性肝炎㊃体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定∗霍云飞,寇卜心,柴梦音,豆双双,高明慧,石英,刘晓霓㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达㊂方法㊀设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列㊂shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,并采用Western Blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果㊂结果㊀测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429㊁pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7ˑ108TU/mL㊁6.1ˑ108TU/mL和6.4ˑ108TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后,与对照慢病毒(pHS-ASR-LW429)比,经Western Blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦结果显示两个Lenti-shTP53BP2均能显著下调HepG2细胞TP53BP2基因水平和蛋白表达量㊂结论㊀本研究成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体,其能有效下调HepG2细胞TP53BP2的表达,为进一步研究TP53BP2在肝癌发生发展过程中的机制研究奠定了基础㊂㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀HepG2细胞;肿瘤蛋白p53结合蛋白2;短发夹RNA;慢病毒;体外㊀㊀DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.02.004㊀㊀Construction and functional verification of a shRNA lentiviral vector targeting to TP53BP2gene in HepG2cells in vitro㊀Huo Yunfei,Kou Buxin,Chai Mengyin,et al.Beijing Institute of Hepatology,You an Hospital,Capital Medical University, Beijing100069,China㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀The present paper aimed to inhibit the expression of tumor suppressor p53-binding protein2 (TP53BP2)in liver cancer by short hairpin RNAs(shRNAs)with lentiviral vector.Methods㊀Two pairs of RNA interference sequences targeting to TP53BP52gene were designed,and their corresponding shRNA sequences were synthesized.After annealing of shRNA to form double-stranded oligo sequences,the recombinant plasmid was constructed by gene recombination technique. The correct recombinant plasmid was used after PCR and sequencing identification of the colony for lentivirus packaging and titer determination.The interference effect of lentivirus lenti-shTP53BP2on TP53BP2gene in HepG2cells was observed by Western Blot,qRT-PCR and laser confocal technique.Results㊀The sequencing alignment results showed that each recombinant lentiviral vector was consistent with the designed reference sequence,indicating that each recombinant lentiviral vector was successfully constructed;the titers of pHS-ASR-LW429,pHS-ASR-LW512and pHS-ASR-LW513were9.7ˑ108TU/mL,6.1ˑ108TU/mL and6.4ˑ108TU/mL,respectively;the HepG2cells were infected with lentivirus lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512and pHS-ASR-LW513),and the results of Western blot,qRT-PCR and laser confocal technique showed that the two lenti-shTP53BP2significantly down-regulated the TP53BP2RNA level and itsprotein expression in HepG2cells as compared with the controllentivirus(PHS-ASR-LW429).Conclusion㊀In this study,we successfully construct the shRNA lentiviral vector targeting toTP53BP2gene with the capacity of effectively down-regulation ofTP53BP2expression in HepG2cells,which might lay afoundation for further research on the mechanism of TP53BP2inthe hepatocarcinogenesis.㊀㊀ʌKey wordsɔ㊀HepG2cells;Tumor suppressor p53-binding protein2;Short hairpin RNA;Lentivirus;In vitro㊀㊀据2019年世界卫生组织统计,恶性肿瘤是大多数国家70岁前死亡的第一或第二大主要原因[1]㊂肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一,在2020年统计研究时显示其新发病例数和死亡病例数分别位居第六位和第三位,依然存在复发率高和生存率低的问题[1-3]㊂肿瘤抑制蛋白p53结合蛋白2(tumor sup-pressor p53-binding protein2,TP53BP2),又称p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein2of p53,ASPP2),是一个由TP53BP2基因编码的全长为1128个氨基酸的肿瘤抑制因子[4]㊂在其C端, TP53BP2具有一个富含脯氨酸结构域(Pro),四个锚蛋白结构域(Ank)和一个SH3结构域;在其N端, TP53BP2具有一个泛素样折叠结构(ULD)和一个α-螺旋结构[5]㊂TP53BP2表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系㊂研究显示,胃癌[6]㊁乳腺癌[7,8]㊁子宫内膜癌[9]㊁口腔癌[10]等多种恶性肿组织TP53BP2呈低表达,而TP53BP2表达与肝癌的发生发展的关系日益得到关注㊂RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的双链RNA诱发的基因沉默现象,能特异性干扰靶基因的表达[11]㊂慢病毒载体能稳定介导基因沉默,具有转染效率高和稳定表达的优势[12]㊂本研究旨在构建靶向TP53BP2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达,为后续TP53BP2在肝癌发生发展中的机制研究奠定基础㊂1㊀材料与方法1.1质粒㊁慢病毒载体㊁细胞与试剂㊀质粒小量快速提取试剂盒(Aidlab公司);限制性内切酶(Thermo 公司);慢病毒载体pLV-hU6-shRNA-hef1a-mNeon-green-P2A-Puro购自北京合生基因科技有限公司㊂HepG2细胞和293T细胞均由本实验室保存㊂T4 DNA ligase㊁慢病毒包装试剂盒㊁EpFect Transfection Reagent㊁EvaGreen2ˑMaster Mix(Syngen Tech公司);FastPure Cell/tissue Total RNA Isolation Kit V2 (Vazyme公司);PrimeScriptTM II1ST Strand cDNA Synthesis Kit㊁TB Green Premix Ex TaqTM(Takara公司);彩虹180广谱蛋白Marker(Solarbio公司); DMEM培养基㊁胎牛血清和Puromycin(Gibco公司);抗β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司);抗TP53BP2单克隆抗体(Abcam公司)㊂1.2目的基因干扰靶点的设计㊀根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology In-formation,NCBI)提供的TP53BP2基因的核酸序列,设计siRNA靶向序列和阴性对照序列(表1)㊂表1㊀siRNA靶向序列siRNA㊀㊀靶向序列TP53BP2shRNA01GGATCTGACTCTTGCTGAACT TP53BP2shRNA02GCTGAGAATCAGGAAGCTAA NC shRNA03AAACGTGACACGTTCGGAGAA 1.3shRNA的合成及退火㊀shRNA由北京合生基因科技有限公司进行合成㊂在合成的shRNA中,loop 茎环结构为CGAA(表2)㊂将合成的单链shRNA用oligo annealing buffer溶解成20μM,互补单链各取30μl进行混合,置于95ħ水浴锅中加热5min,然后室温冷却,形成双链oligo片段㊂取双链oligo片段1μl用于后续的连接反应,其余置于-20ħ保存㊂表2㊀TP53BP2基因沉默慢病毒载体信息载体编号载体内容shRNA序列pHS-ASR-LW512TP53BP2shRNA015 -GGATCTGACTCTTGCTGAACT CGAAAGTTCAGCAAGAGTCAGATCC-3 pHS-ASR-LW513TP53BP2shRNA025 -GCTGAGAATCAGGAAGCTAAG CGAACTTAGCTTCCTGATTCTCAGC-3 pHS-ASR-LW429NC shRNA035 -AAACGTGACACGTTCGGAGAA CGAATTCTCCGAACGTGTCACGTTT-31.4载体质粒与退火的shRNA连接㊀取载体质粒pLV-hU6-shRNA-hef1a-mNeongreen-P2A-Puro,经BsaI酶切线性化后与退火的双链oligo序列在表3的连接反应体系下于16ħ过夜连接,完成慢病毒基因沉默质粒构建(图1)㊂其中,阳性对照所加的退火的双链oligo是经验证连接效果较好的片段,与连接组所加的退火的双链oligo长度一样,但与目的序列无关㊂表3㊀连接反应体系试剂阳性对照(μL)自连对照(μL)连接组(μL)退火的双链oligo10mM1 1线性化的干扰载体40ng/μL333 10ˑT4DNA ligase Buffer222 T4DNA ligase111 dd H2O Up to20Up to20Up to20图1㊀TP53BP2基因沉默慢病毒质粒示意图1.5转化㊁菌落鉴定与测序㊀用构建完成的质粒转化DH5α感受态细胞,然后涂布于含有氨苄西林(ampi-cillin,Amp)抗性的LB固体培养基平板,37ħ培养过夜㊂经培养后挑取单一菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆,对得到的阳性克隆进行测序验证(测序引物序列:CAGGAAGAGGGCCTATTTCCC)㊂对经测序验证正确的阳性克隆,用质粒小量快速提取试剂盒提取质粒,取提取出的质粒用于慢病毒的包装㊂1.6慢病毒包装㊀取3~5ˑ106个293T细胞,接种于10cm细胞培养皿中,置于37ħ,5%CO2的培养箱中过夜培养㊂然后,使用慢病毒包装试剂盒中的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)和EpFect Transfection Reagent等试剂进行慢病毒包装系统转染㊂在转染48h后,收集含有慢病毒的上清液,更换新鲜培养基继续培养24h,再次收集上清㊂将收集到的上清和浓缩试剂按照5:1的比例在4ħ过夜进行混合㊂混合后,在4ħ,4000g条件下离心30min,收集沉淀㊂使用PBS重悬沉淀,即得到病毒浓缩液㊂将收集到的病毒浓缩液分装,保存于-80ħ㊂1.7慢病毒滴度测定㊀取1ˑ105个293T细胞,接种于6孔板,置于37ħ,5%CO2的培养箱中过夜培养,用于病毒滴度测定㊂每种病毒分别按0.1μL㊁1μL和10μL体积接种3个孔,并添加终浓度为8μg/mL的促感染试剂Polybrene㊂培养72h后拍照,记录病毒感染后的情况并提取基因组DNA,用于qRT-PCR检测㊂qRT-PCR实验的扩增/检测对象为慢病毒载体上的WPRE序列(WPRE序列可以随目的基因整合入细胞基因组)㊂根据公式TU ml-1= (CˑNˑDˑ1000)/V,即可计算出慢病毒滴度㊂其中,C为平均每基因组整合的病毒拷贝数;N为感染时细胞的数目;D为病毒载体的稀释倍数,V为加入的稀释病毒的体积数(μL)㊂1.8慢病毒转染HepG2细胞和干扰效果鉴定㊀取1ˑ105个HepG2细胞,接种于6孔板,过夜培养后,在孔中加入慢病毒和8μg/mL的Polybrene㊂每孔所加病毒量(μL)=MOIˑ感染时的细胞数/病毒滴度ˑ1000,其中HepG2的MOI值为10~30㊂转染24h 后更换新鲜培养基,继续培养24~48h,拍照,记录感染情况,并加入嘌呤霉素筛选转染成功的细胞㊂收集转染成功的HepG2细胞,分别采用Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察TP53BP2基因在蛋白质和mRNA水平上的表达情况㊂GAPDH 和TP53BP2引物序列见表4㊂表4㊀qPCR引物序列名称序列GAPDH F:GGAGCGAGATCCCTCCAAAATR:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGGASPP2F:ATTCGTCTTTGGAGGGAGAR:ATTGTGAAGAGCCGTGATG1.9统计学方法㊀计量资料以xʃs表示,采用Student s t检验,应用SPSS24.0软件进行分析,P< 0.05为差异有显著性统计学意义㊂2㊀结果2.1TP53BP2基因沉默慢病毒质粒载体构建成功㊀我们将退火的双链oligo序列与经BsaI酶切割后的线性化载体在T4DNA ligase的作用下进行连接,并经菌落PCR筛选阳性克隆和DNA测序,测序比对结果显示各重组质粒载体序列与设计序列一致(图2)㊂由此可见,pLV-hU6-shTP53BP2-hef1a-mNeongreen-P2A-Puro质粒(pHS-ASR-LW512; pHS-ASR-LW513)构建成功㊂图2㊀TP53BP2基因沉默慢病毒质粒测序比对结果A:pHS-ASR-LW429;B:pHS-ASR-LW512;C:pHS-ASR-LW513 2.2慢病毒Lenti-shTP53BP2包装和滴度检测情况㊀我们采用慢病毒包装试剂盒和293T细胞包装基因沉默慢病毒质粒,48h后在荧光显微镜下观察到所有细胞均具有GFP绿色荧光,说明慢病毒包装成功(图3)㊂提取经慢病毒转染后的293T细胞基因组DNA,进行qRT-PCR检测,经数据分析得出慢病毒的滴度,其中pHS-ASR-LW429为9.66ˑ108TU/ mL,pHS-ASR-LW512为6.13ˑ108TU/mL,pHS-ASR-LW513为6.36ˑ108TU/mL(表5㊁表6和表7)㊂2.3Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞干扰效果情况㊀我们使用Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)和对照Lenti-NC shRNA(pHS-ASR-LW429)转染HepG2细胞24h后,更换新鲜培养基继续培养24~48h,添加含有6μg/mL嘌呤霉素的培养基进行筛选㊂当未转染慢病毒的细胞在含有嘌呤霉素的培养基中全部死亡后,转入2μg/mL 嘌呤霉素的培养基维持筛选,所有细胞表达GFP绿色荧光,提示转染成功(图4A)㊂经Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察HepG2细胞TP53BP2表达,发现在mRNA水平和蛋白质水平上pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513两种慢病毒感染的HepG2细胞TP53BP2表达均显著降低(图4 B~E)㊂表5㊀pHS-ASR-LW429滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11047.22ˑ10519.4ˑ10821 5.12ˑ1051 1.0ˑ1099.7ˑ108 30.10.52ˑ10519.4ˑ108表6㊀pHS-ASR-LW512滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11032.62ˑ1051 6.5ˑ10821 3.42ˑ1051 6.9ˑ109 6.1ˑ108 30.10.32ˑ1051 5.0ˑ108表7㊀pHS-ASR-LW513滴度测定项目V值(μL)C值N值D值滴度(TU/mL)平均滴度(TU/mL) 11028.42ˑ1051 5.7ˑ10821 3.32ˑ1051 6.6ˑ109 6.4ˑ108 30.10.32ˑ1051 6.8ˑ1083㊀讨论TP53BP2作为一个重要的肿瘤抑制基因,在肿瘤,尤其是肝癌的发生发展过程中发挥着重要作用㊂研究表明,TP53BP2参与自噬[13]㊁细胞增殖[14]㊁化疗耐药性[15,16]等信号的调节,影响着肝癌的发生发展和患者预后㊂我们先前的研究也发现,敲除TP52BP2基因可促进二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌的发生[17]㊂本研究针对TP53BP2基因设计合成了2条RNA干扰寡核苷酸链,采用基因重组技术和慢病毒包装技术成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体㊂进一步利用成功构建的Lenti-shTP53BP2慢病毒转染HepG2细胞,经Western blot㊁qRT-PCR和激光共聚焦技术观察其靶向沉默图3㊀TP53BP2基因沉默慢病毒包装过程中239T 细胞GPF 绿色荧光表达情况(48h)图4㊀Lenti -shTP53BP2对HepG2细胞的干扰效果A:荧光显微镜观察HepG2细胞经慢病毒感染后GFP绿色荧光表达(100ˑ);B:激光共聚焦观察HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2蛋白表达;C /D:Western blot 验证HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2蛋白表达;E:qRT -PCR 验证HepG2细胞经慢病毒感染后TP53BP2mRNA 水平与pHS -ASR -LW429比,∗P <0.05,∗∗P ∗<0.001TP53BP2基因的效果㊂结果发现无论是从蛋白水平还是mRNA 水平,pHS -ASR -LW512和pHS -ASR -LW513两种慢病毒均能有效抑制HepG2细胞TP53BP2的表达㊂实验的成功为进一步研究TP53BP2基因在肝癌发生发展过程中的机制奠定了基础㊂ʌ参考文献ɔ[1]Sung H,Ferlay J,Siegel R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185countries.Ca Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.[2]Tian G,Yang S,Yuan J,et parative efficacy of treatmentstrategies for hepatocellular carcinoma:systematic review and network meta -analysis.BMJ Open,2018,8(10):e21269.[3]Kulik L,El -Serag H B.Epidemiology and management of hepato-cellular carcinoma.Gastroenterology,2019,156(2):477-491.[4]Samuels -Lev Y,O'Connor D J,Bergamaschi D,et al.ASPP pro-teins specifically stimulate the apoptotic function of p53.Mol Cell,2001,8(4):781-794.[5]Ahn J,Byeon I L,Byeon C H,et al.Insight into the structural ba-sis of pro -and antiapoptotic p53modulation by ASPP proteins.JBiol Chem,2009,284(20):13812-13822.[6]Gen Y,Yasui K,Kitaichi T,et al.ASPP2suppresses invasion andTGF -beta1-induced epithelial -mesenchymal transition by inhibiting Smad7degradation mediated by E3ubiquitin ligase ITCHin gastric cancer.Cancer Lett,2017,398:52-61.[7]Wu T,Song H,Xie D,et al.Mir -30b -5p proliferation,migration,and invasion of breast cancer cells via targeting ASPP2.Biomed Res Int,2020,2020:7907269.[8]Wu T,Song H,Xie D,et al.Silencing of ASPP2promotes theproliferation,migration and invasion of triple -negative breast cancercells via the PI3K /AKT pathway.Int J Oncol,2018,52(6):2001-2010.[9]Konno T,Kohno T,Okada T,et al.ASPP2suppression promotesmalignancy via LSR and YAP in human endometrial cancer.Histo-chem Cell Biol,2020,154(2):197-213.[10]Patel K D,Barasiya Y V,Patel J B,et al.Apoptosis stimulatingprotein of p53(ASPP)1and ASPP2m -RNA expression in oral cancer.Arch Oral Biol,2020,119:104920.[11]Mondal M,Klimov P,Flynt A S.Rewired RNAi -mediated genomesurveillance in house dust mites.PLoS Genet,2018,14(1):e1007183.[12]Poling B C,Tsai K,Kang D,et al.A lentiviral vector bearing a re-verse intron demonstrates superior expression of both proteins andmicroRNAs.RNA Biol,2017,14(11):1570-1579.[13]Chen R,Wang H,Liang B,et al.Downregulation of ASPP2im-proves hepatocellular carcinoma cells survival via promoting BECN1-dependent autophagy initiation.Cell Death Dis,2016,7(12):e2512.[14]Liang B,Chen R,Song S,et al.ASPP2inhibits tumor growth byrepressing the mevalonate pathway in hepatocellular carcinoma.Cell Death Dis,2019,10(11):830.[15]Xu L,Tong X,Zhang S,et al.ASPP2suppresses stem cell -likecharacteristics and chemoresistance by inhibiting the Src /FAK /Snail axis in hepatocellular carcinoma.Tumour Biol,2016,37(10):13669-13677.[16]Yang T,Gao Y,Liu D,et al.ASPP2enhances chemotherapeuticsensitivity through the down -regulation of XIAP expression in a p53independent manner in hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun,2019,508(3):769-774.[17]Wang S,Kou B,Chai M,et al.Knockout of ASPP2promotes DEN-induced hepatocarcinogenesis via the NF -kappaB pathway inmice.Cancer Gene Ther,2022,29(2):202-214.(收稿:2022-10-14)(本文编辑:陈从新)。

肿瘤研究——SIRT1蛋白，TP53蛋白和p53蛋白
MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。

到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA 分子。

大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中。

近期，microRNA被发现与预防肿瘤有一定的关系，而且该分子可以改变其结构，从而控制细胞中蛋白质的产生。

众所周知microRNA能够沉默mRNA分子，从而阻止蛋白质的产生。

这意味着它们有可能被用作药物的工具或靶标。

p53功能的改变在人类癌症中很常见，该蛋白质对于预防癌症形成的能力极为重要。

揭示了对基于结构学和动力学的小microRNA如何控制蛋白质输出调控的初步了解，为开发具有全新作用机制的药物打开了大门。

艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商，推荐Abbexa品牌的肿瘤研究相关SIRT1蛋白，TP53蛋白和p53蛋白等。

产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

Abbexa公司位于英国剑桥，提供和经销生命科学,制药和生物技术方面的产品。

产品线包括一抗、二抗、同型对照、蛋白质、酶联免疫（ELISA）试剂盒和酶等生物试剂。

与世界各地的实验室合作，致力于为生物医学研究市场开发相关的，经过测试的高质量产品。

Abbexa的主要产品：一抗、二抗、同型抗体（Isotype Control）、ELISA试剂盒，以及其他试剂盒及产品。

p53基因检测试剂盒（荧光原位杂交法）说明书【产品名称】通用名称：p53基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）英文名称：FISH detection Kit for the p53 gene【包装规格】10人份/盒、20人份/盒【预期用途】本产品用于检血液、骨髓、尿液等组织样本中细胞p53基因缺失情况。

以辅助诊断和治疗。

【检验原理】荧光原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能够使细胞中特定的核苷酸片段通过荧光而清楚的呈现，FISH试验过程中包含了双链DNA的解链，荧光标记的DNA探针能够与目标序列结合[2-3]。

杂交完成之后，多余的探针被清洗掉，同时，细胞核被复染剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的荧光。

本试剂盒包含一组探针：CEP17(绿色)位点和p53（红色）位点及FISH操作配套试剂。

正常细胞信号方式：每个细胞显示两个绿色信号及两个红色信号（即2G2R）。

异常细胞信号方式：细胞中出现两个绿色信号且红色信号少于两个。

【主要组成成分】【储存条件及有效期】p53/CEP17探针及DAPI于-20℃避光、密封储存；不应与有毒、有污染和有不良气味的物品混存；开封后，探针及DAPI 24小时内可在2-8℃避光、密封储存；24小时内不能使用完的，请放置于-20℃±3℃避光、密封储存；自生产之日起有效期为一年。

【适用仪器】本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如ThermoBrite。

本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。

所需荧光显微镜的配置包括：物镜：在FISH分析上，使用100×消色差浸油类型物镜可取得满意效果。

镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在荧光显微镜上使用。

滤光片：建议客户处客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。

人P53(P53)试剂盒使用方法检测范围：96T50pg/ml-1600pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中P53（P53）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人P53水平。

用纯化的人P53抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P53，再与HRP标记的P53抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的P53呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人P53浓度。

标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。