动物组织淋巴细胞分离液使用说明

一、采集血样，室温保存。

使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。

一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。

二、提取淋巴细胞。

在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。

然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。

（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。

1500rpm,15min,20摄氏度。

说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。

实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。

2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。

（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。

适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。

最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。

3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。

大鼠骨髓淋巴细胞分离液使用方法
大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法如下：
1. 悬浮细胞：将需要进行分离的细胞悬浮在分离液中。

2. 离心：将悬浮液在2000rpm的转速下离心5分钟，收集沉淀的细胞。

3. 清洗：使用清洗液清洗离心后的细胞沉淀，以去除杂质和多余的分离液。

4. 再次离心：将清洗后的细胞在相同条件下再次离心，以进一步纯化细胞。

5. 培养：将纯化后的细胞接种到培养基中进行培养，以进行后续的实验或研究。

需要注意的是，大鼠骨髓淋巴细胞分离液需要在无菌条件下操作，且启封后应置常温保存。

如果需要在4℃保存，应避免出现白色结晶，以免影响分离效果。

此外，该试剂盒易感染细菌，因此在使用过程中需要特别注意无菌操作。

以上是大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法，仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅相关网站。

各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项：各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项: 本品为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液。

主要成分是Ficoll 400与泛影酸葡甲胺。

适用于从血液及组织匀浆中(小牛血清或人血清悬起匀浆的细胞 1X107/ml)分离所需细胞，在医疗和医学生物中广泛应用。

其他人及动物多种比重细胞分离液。

注:因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，所以用户在定制分离液时应提供所需分离液的比重、动物的种属及被分离细胞的名称。

使用方法例:取新鲜抗凝血1ml，与全血及组织匀浆稀释液(LOT#:2010C1119)液1:1 混匀后，小心加于2ml的细胞分离液之液面上，以1500-2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。

第一层;为血浆或组织匀浆液层。

第二层;为环状乳白色淋巴细胞。

第三层;为透明分离液层。

第四层;为红细胞层，收集第二层细胞放入含细胞洗涤液 (LOT#:2010X1118)4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10-30分钟。

沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

(此方法效果较好，推荐使用)注意事项1. 启封后应置4?保存避免微生物的污染。

2. 细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用。

3. 整个分离过程中，温度应控制在18-28?且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。

应用-从动物血液及组织中分离所需细胞特点-密度变化率依照Ficoll 400，泛影酸和氢氧化钠. -最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数 -在低粘度时高密度 -无菌-即用型-溶液产品规格溶液水PH 7.0-7.5渗透压 280-340mOsmol/kg 内毒素 <5EU/ml 无菌已检测保存期限 2年贮藏 +18?-+25?注意TBD实验室的细胞分离培养基是敏光型的。

实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。

外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。

此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。

【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。

市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。

将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。

【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。

2.5g/L台盼蓝。

3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。

4.Hank,s液。

5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。

6.水平离心机、显微镜。

【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。

再加入等量Hank,s液混匀。

2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。

稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。

3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。

4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。

腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。

放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。

消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。

剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。

仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。

以下过程注意无菌操作。

小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。

用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。

向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。

用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。

再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。

平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。

视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。

研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。

研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。

实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。

脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。

研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。

实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。

实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。

2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。

3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。

免疫细胞使用说明书（V1.0）【适用范围】该产品说明书适用于人和动物PBMC、SMC、CBMC、BMMNCs等单个核细胞和人、小鼠CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、单核、NK细胞等亚型免疫细胞的复苏、保存、使用等过程。

【产品描述】单个核细胞是白细胞中只有一个细胞核的细胞，相对密度在1.076~1.090。

根据其组织来源不同，又可分为外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）、脐带血单个核细胞（Cord Blood Mononuclear Cell，CBMC)、脾脏单个核细胞（Spleen Mononuclear Cell）、骨髓单个核细胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs）等。

IPHASE单个核细胞均是由新鲜的组织或器官，利用细胞比重的差异，通过密度梯度离心的方法获得。

免疫细胞（Immune cell），由多种不同类型的细胞组成，包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等。

免疫细胞作为免疫系统的重要成员，具有吞噬异物并产生抗体、机体伤病的损伤治愈、抗御病原体入侵等能力，在执行免疫应答和免疫功能方面担负重任。

IPHASE免疫亚型细胞均是通过免疫磁性细胞阴选分选的方法，从新鲜制备的单个核细胞悬液中分选而来。

【包装规格】5×106cells/管1×107cells/管2×107cells/管5×107cells/管【应用方向】可作为大分子药物临床前药代动力学和药效学研究、药物毒性筛选、免疫学研究、疫苗开发以及移植免疫等多个领域研究的原材料。

【合规保障】合规是研究的开始。

按照国家要求，凡涉及到人和猴相关的细胞产品均需办理合规审批流程，只有审批通过，且取得证明文件后才可买卖细胞。

IPHASE/汇智和源分离免疫细胞的组织或器官均由合规渠道获得，来源清晰，免除客户后顾之忧。

1、Treg细胞概述高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大降低，移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。

但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用(如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等)及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。

因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。

在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。

该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答／免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

2、Treg细胞的来源研究证实，天然的CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。

而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。

这说明出生3d内是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。

但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺，小鼠不出现自身免疫性疾病。

Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25+胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。

腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。

放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。

消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。

剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。

仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。

以下过程注意无菌操作。

小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。

用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。

向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。

用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。

再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。

平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。