02 基因组学课件---遗传图绘制

第2章 遗传图绘制
基因组计划包括三个阶段工作： 遗传图的构建 物理图的构建 DNA全序列测定
？每次测序反应可阅读的DNA长 度<1000bp
(Also known as a linkage map) a chromosome
map of a species that shows the position of its known genes and/or markers relative to each other, rather than as specific physical points on each chromosome --------Dr. Eric Green, of the National Human Genome Research Institute's Genome Technology Branch, defines genetic map
+ 建立含有单条人染色
体的体细胞杂交
+ 将连锁分析原理用于杂种细胞染色体分析的方法称为同线
分析 + 连锁分析主要是依据两观侧基因的分离及性状重组情况， 通过重组值来判断基因在染色体上的分布 + 当重组值为50%时，可能性有三种：
– ①位于不同染色体上 – ②位于同一染色体臂，但距离较远 – ③位于着丝点两侧
+ 原位杂交
+ 标记构建 – 第一代标记是限制性片段长度多态性RFLP – 第二代标记位点是大量的可变数量串联重复 （VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复 (STR 或SSLP) – 第三代标记是位点极其丰富的单核苷酸多态性 (SNP)
+ 原位杂交(in situ hybrization)是Hogness G于
图 10 在作图中用 DNA 指纹作为标记
+ 单核苷酸多态性(SNP)
是第三代标记，被用 于遗传图谱构建及功 能分析 + 由于SNP在不同个体间 和不同组织、细胞间 高度多态性，使其成 为研究基因多样性和 识别、定位疾病相关 基因的一种新型手段
检测SNP的特异杂交
DNA芯片（DNA chip）技术
DNA芯片
动态等位专一性杂交（Dynamic allelespecif于96孔板的每个凹槽 中，由于荧光标记试剂只与双链DNA结合，所以 只有可杂交的分子发出荧光 实验初始时保持可使单个碱基错配的反应条件， 此时寡聚核苷酸可与任何等位SNP分子杂交 随后逐步提高反应温度，由于完全互补配对的杂 交分子较之含有错配硷基的杂交分子可耐受较高 的温度 当反应温度升高到临界点时，含有错配的杂交分 子将会解链，荧光信号同时消失，说明该样品中 含有SNP
+ 体细胞杂交定位法(somatic cell hybridization)
+ 应用不同物种的细胞培养获 得 杂种细胞系
(hybrid cell line)，根据不同杂种细胞中保留 的极少数人的染色体与某些相关基因的对 应关系进行基因定位的方法
+ 染色体定位的方法： + 同线分析法 + 克隆分布板法
+ 染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的
DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子 标记技术 + 目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交 技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧 光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针 分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上 的位置
+ 通过诱变剂处理人的细胞，将含有断裂染色体的
细胞与小鼠细胞融合，筛选含有缺失人的染色体 片段的杂种细胞 + 先使人鼠细胞杂交，获得含有人的一条染色体的 杂种细胞系，再使其断裂，分离不同断裂类型的 亚克隆 + 前者可获得不同染色体的许多缺失杂种。后者只 获一种特定染色体的某些缺失杂种。对区域定位 来讲，后者更为便利。通过染色体结构变异已经 定位了一些人类疾病基因
Mechanism of DNA cleavage by the restriction enzyme BamHI
In a RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA
Southern blot
– 采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色 体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。 – 遗传图距单位:厘摩(centi-Morgan, cM), 每单位厘摩定义 为1%交换率
+ 物理作图（Physical mapping）
– 采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆 标定在基因组实际位置。 – 物理图的距离依作图方法而异
+ 小卫星DNA的核心序列
一般为几个到几十个 核苷酸，不同个体的 不同基因座位重复次 数不同，每个重复单 位的组成可略有变异 + 位置：一般在染色体 端粒部位，广泛存在 于人体基因组中
+ 微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记 + 属高度重复序列，重复单元2~6bp，如(CA)n、(AT)、
+ RFLP是指不同个体基因
组内的核苷酸序列因某 种原因产生碱基突变后， 改变了某种限制性内切 酶的剪切位点，形成了 长度不等的限制性片段 + 限制性片段在人类不同 个体间呈现的多态性现 象称为限制片段长度多 态性
RFLP的特征
RFLP是第一种被用于作图研究的DNA标 记，它们一般有如下特征 处于染色体上的位置相对固定 同一亲本及其子代相同位点上的多态 性片段特征不变 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段， 具有共显性特点
– 家系分析法 – 体细胞杂交定位法等 – 染色体易位作图、染色体缺失作图：体细胞杂交定位中 较为精细的方法
+ 家系分析法(pedigree method)
– 对某家庭性状相关成员进行 统计，分析性状之间的连锁关 系，通过重组率进行相关基因定位，这种方法称为家系分析 法，又称系谱分析法 – 1968年约翰霍普金斯大学的学生Donahue在做染色体实验时 发现自己的1号染色体缢痕区增长，通过对他自己家族染色 体的观察，进一步发现这一异常是遗传的，并与特殊血型 （Fy）具有平行性，因此将血型基因定位于1号染色体上， 这是首次定位常染色体上的基因，从而建立了细胞学定位法 – 1973年发现第二条染色体短臂缺失（2P－）的患者红细胞酸 性磷酸酶（ACP－1）活性明显降低，于是将此酶定位于第2 条染色体上，这就是利用剂量效应的方法
荧光标记原位杂交原理示意图
+ 制备探针 + 染色体制片 + 染色体处理与变性 + 染色体与探针杂交
+ 显微检测
+ 基因标记 – 缺点：高等生物基因组很大，而基因的数目是 十分有限的，许多性状都涉及多基因 ，基因组 中存在大量的基因间隔区，纯粹用基因作为标 记将在遗传图中留下大片的无标记区段
对于人类来说，SNP的意义在于： + 致病SNP + 疾病易感性SNP + 具有诊断价值的SNP + 疾病的SNP谱 + 人表型相关SNP + 药物作用与不良反应的SNP + 药物剂量SNP
日本研究人员最近
经过研究发现，与 糖尿病有关的基因 并不是千篇一律， 它们之间存在着个 人差别，即“单核 苷酸多态性”（SNP）
(GGC)n等重复，重复区大多几十~几百bp，分散在基 因组中
+ 呈现孟德尔式遗传 + 目前微卫星DNA已经发现了２万余个位点
TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG
微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：
1975年首次提出的多态性标记的检测方法 + 基础：分离和克隆获得的基因或随机片段，将这 些克隆片段用同位素、生物素或荧光染料进行标 记后，作为探针，直接在玻片上与细胞分裂中期 染色体DNA进行杂交，经过放射性自显影或荧光信 号显示，确定这一基因在染色体上的杂交位置 + 统计、分析、汇总各中期细胞内的染色体结果， 选出杂交最集中的染色体区域，便是该基因在染 色体上的具体位置

辐射杂种（radiation hybrid）作图的计算单位为厘镭(cR) 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对
+ 绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因座位的
顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同 性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的连 锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图 + 方法：
+ 伴性遗传法主要是根据人类性染色体组成和伴性遗传原理
进行XY染色体上基因的定位 + Y染色体——“全男性遗传” + 蹼趾男人：美国的斯柯菲尔德家庭的14个男人在其第2～3 趾间都长有一个蹼状的联系物（如同鸭子脚上的蹼），而 患者的11个女儿没有一个有此性状，这些女子结婚后子女 也没有带此性状的，因而认为蹼趾是Y伴性遗传。但是蹼趾 这个症状也有男女都有的，只是男患者多于女患者。因此， 有人认为蹼趾的遗传性尚不能完全肯定为Y伴性遗传 + 长毛耳男人 ：患者的耳廓上长有长而硬的毛。这种病在印 第安人中发现的较多，高加利索人，澳大利亚土人、日本 人、尼日利亚人中也有少数发现
PCR（Polymerase chain reaction）
The first 4 cycles of PCR in detail
有二种类型的SSLP常用于作图：
小卫星序列（minisatellite），有时又称 可 变 串 连 重 复 （ variable number of tandem repeats, VNTR），其重复单位的 长度为数十个核苷酸 微卫星序列（microsatellite）或简单串 联重复（simple tandem repeats, STR or SSR），其重复单位为1-6个核苷酸，由 10-50个重复单位串联组成