【培训课件-临床基因组学】_第七章 Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学

Illumina MiSeq
NextSeq 500
Life Ion PGM; Ion proton
Roche 454 Genome Sequencer
• GS FLX • GS Junior System
Ge flow order repeats with pattern:
‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’
T ACG T ACG T C T GAGCA T CGA
T
Flows 1-4 Flows 5-8 …9-12
… etc.
A
C
Ion
Sphere
-----Primer------
• 外显子测序（whole exon sequencing） 指利用序列捕获技术将全基因组外 显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
• Contig 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig （重叠群）。
• Scaffold 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要 构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如 3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些 Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。
• 1990年，被誉为生命“登月计划”的国 际人类基因组计划启动。
• 1999年9月，中国加入这一研究计划， 负责测定人类基因组全部序列的1％。
• 2003年完成，比预计提前2年。
• 六国（美、日、英、法、德、中）科学 家历经了13年花费了27亿美元才完成的 草图。
• 尽管第一代测序技术已经帮 助人们完成了从噬菌体基因 组到人类基因组草图等大量 的测序工作，但由于其存在 成本高、速度慢等方面的不 足，并不是最理想的测序方 法。
A
G
T
C
A
A
G
C
G
T
C
C
C
A
T
G...---Ion Sphere™
Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 1-4
焦磷酸测序
数据分析
polymerase
(DNA)n + dNTP
(DNA)n +1 +PPi
Sulfurylase
ATP
APS+PPi
Lucifetase
ATP + luciferin
oxyluciferin
dNTP Apyrase ATP Apyrase
dNDP + dNMP + phosphate ADP + AMP + phosphate
• Reads 又称读长，高通量测序中一个反应获得的测序序列或测序出来 的一条条序列 。
• 测序深度 是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设 一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。
• 覆盖度 是指测序获得的序列占整个基因组的比例。
高通量测序平台
Roche 454 Genome Sequencer FLX
“下一代”测序技术
Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分 子进行序列测定，效率极高
• 技术特点：每次测很短的片段 （读长较短），但是可以通过 超大量的平行测序，获得大量 的序列。
高通量测序的常用名词
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条 核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术 (next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测 序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)
• 基因组重测序（Genome Re-sequencing） 是对基因组序列已知的个体 进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
• de novo测序 也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对 某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装， 从而获得该物种的基因组图谱。
Clonal Amplification
Isolate Positive Ion Sphere™ Particles
Template Preparatquence
DNA Sequencing*
Data Analysis
Data Analysis
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
To column receiver
Sequencing: Flows
• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a wa序
数据分析
序列是什么呢？ ....
Life Technology Ion平台
Ion PGM™ 系统
Ion Proton™系统
Ion S5™ 系统
Ion Chef™ 系统
Ion torrent PGM的基本原理
DNA / RNA
Prepare Library
Library Preparation
临床基因组学 第七章
Sanger测序及高通量测序技术
• 第一节 核酸测序技术的发展 • 第二节 Sanger测序技术 • 第三节 高通量测序技术及其应用
第三节 高通量测序技术及其应用重点
高通量测序的发展 第二代测序的基本原理及操作流程 第三代测序的基本原理 高通量测序的结果分析及临床应用
• 人类基因组约含4万到10万个基因，由 约30亿个碱基对组成，分布在细胞核的 23对染色体中。