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高通量测序技术及原理介绍ppt课件

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高通量测序原理课件

高通量测序原理课件
传统的测序方法，适用于小规模测序项目。
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。

高通量测序技术简介

高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

高通量测序技术简介

高通量测序技术简介
使用高分辨率成像系统对测序芯片上的荧光 信号进行图像采集。
数据转换
将采集到的图像数据转换为对应的碱基序列 信息。
质量控制
对转换后的数据进行质量评估和控制，以确 保测序结果的准确性和可靠性。
数据输出
将最终测序结果以FASTQ等格式输出，供后 续生物信息学分析使用。
03
高通量测序技术平台
Illumina平台
伦理规范制定
制定高通量测序技术应用的伦理规范，确保 技术的合理、安全使用。
法规监管和政策支持
加强高通量测序技术的法规监管和政策支持， 推动技术的健康发展。
THANKS
感谢观看
Genia Technologies平台
采用基于光学干涉的测序技术，通过检测DNA分子在光学干涉仪中的干涉信号变化实 现测序，具有高精度、高灵敏度等优势。
04
高通量测序技术在基因组学研究 中的应用
全基因组重测序
定义
全基因组重测序是对已知基因组 序列的物种进行不同个体的基因 组测序，并在个体或群体水平上 进行差异性分析的方法。
该技术能够在短时间内产生大量的序 列数据，为基因组学、转录组学、宏 基因组学等领域的研究提供了有力支 持。
发展历程及现状
第一代测序技术
以Sanger测序为代表，具有读长较长、准确性高的优点， 但通量低、成本高，难以满足大规模测序需求。
第二代测序技术
以Illumina公司的HiSeq系列、Life Technologies公司的 SOLiD系列等为代表，实现了高通量、低成本的目标，广泛应
高通量测序技术简介
• 引言 • 高通量测序技术原理 • 高通量测序技术平台 • 高通量测序技术在基因组学研究中
的应用
• 高通量测序技术在临床医学中的应 用

高通量测序技术及实用数据分析ppt课件

高通量测序技术及实用数据分析ppt课件

第三代测序：单分子测序
不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代 分子测序，不需要进行PCR扩增。
早在2008年，HelicoBio Science 公司的Harris等在Science上报道了他们开发的 TIRM（total internal reflection microscopy）测序技术。
;.
18
Ion Torrent测序技术：
使用半导体技术将生化反应与电流强度直接联系。在聚合酶反应时，每聚合 一个碱基会释放出相应的质子，引起周围环境PH的变化，将PH变化转化为 电流的变化，最终记录电流信号，获得测序序列。读长约200bp，根据芯片 不同可以一次产生10M-20G的数据。
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物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到
实时测定DNA序列的目的。
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Hiseq2000/Hiseq1000（HIseq2500/Hiseq1500）平台简介： 原理：基于DNA单分子簇边合成 ➢ 将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸
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常见的高通量测序测序平台
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焦磷酸测序技术：引物与模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP
sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引
• 每一个k-mer作为图中一个节点，两 个k-mer如果在同一read中相邻，则 形成一个边。

高通量测序技术的类型原理及应用--ppt

高通量测序技术的类型原理及应用--ppt

高通量测序技术的优点
大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片进行测序，可以在
数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极 致。
成本低廉：利用高通量测序技术进行人类基因组测
序，耗资不到传统测序法的1%。
高通量测序技术的优点
第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚 合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、 底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。
2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与 模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出 等摩尔数的焦磷酸。
类型及原理
目前，所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推 出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。
第二代测序技术
2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被Roche 公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法 的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序 技术的先河。
高通量测序技术有完美的定量功能：这是因
为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。这一点有望取代以前的基因表达芯片 技术用于基因表达的研究。
高通量测序技术的应用
大规模基因组测序 基因表达分析 非编码小分子RNA的鉴定 转录因子靶基因的筛选 DNA甲基化相关研究 其他
全基因组测序
高通量测序技术在发展初期由于读长较短，使 其在对未知基因组从头测序( denovo Sequencing) 的 应用受到限制，只能用于基因组重测序。

高通量测序技术平台流程及应用[PPT课件]

高通量测序技术平台流程及应用[PPT课件]
生物信息组装/分析
Illumina Mate-pair测序流程 基因组DNA随机打断特定大小片段（2-10kb范围可选） ↓
末端修复 ↓
生物素标记 ↓
环化 ↓
获得来自大片段两端共计400-600 bp的DNA片段 ↓
修饰、加接头 ↓
PStation上的成簇扩增 ↓
生物信息学分析
Illumina ChI染P色-质s免e疫共q沉测淀 序流程
↓
目的DNA片段 ↓
DNA片段的末端修复 ↓
将 ‘A’ 碱基加入到 DNA片段的3‘末端 ↓
DNA片段末端加上接头 ↓
PStation成簇扩增 ↓
Illumina Genome Analyzer上的测序 ↓
高通量测序技术平台流程及应用主要内容三大ngs平台方向abisolid系统应用方向rochegsflx系统应用方向基因组dna的随机打断dna片段的末端修复将a碱基加入到dna片段的3末端在dna片段的末端加的成簇扩增illuminagenomeanalyzer上的测序生物信息组装分片段两端共计400600bp的dna片段上的成簇扩增illuminagenomeanalyzer上的测序生物信息组装分析基因组dna随机打断特定大小片段210kb范围可选illuminasmallrna测序流程从总rna中分离smallrna5接头连接和纯化3接tation成簇扩增illuminagenomeanalyzer上的测序生物信息学分析illumina数字化表达谱测序流程cdna第二链的合成限制性内切酶nlaiii的酶切连接gexnlaiiiadapter1限制性内切酶mmei的酶切连接gexadapter2an上的成簇扩增illuminagenomeanalyzer上的测序生物信息学分析mrna的分离和cdna第一链的合成totalrna的dnasei酶消化mrna分离和随机打断cdna第一链和第二链的合成dna片段的末端修复将a碱基加入到dna片段的3末端在dna片段的末端加n上的成簇扩增illuminagenomeanalyzer上的测序生物信息学分析illumina转录组测序流程基因组dna随机打断dna片段的末端修复将a碱基加入到dna片段的3末端dna片段末端加上特别处理的甲基化接头重亚硫酸盐处上的成簇扩增il

高通量测序技术及其在农业上的应用.ppt

高通量测序技术及其在农业上的应用.ppt

3.4 外显子组测序
外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含 合成蛋白质所需的重要信息，涵盖了与个体表型相关的绝 大部分功能性变异，能够直接发现与蛋白质功能变异相关 的遗传突变 。
3.5小分子RNA测序
小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码 RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型 基因调控机制。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物 种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对 个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的 个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸 多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel， Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手 段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完 成注释。
Moxon等利用454－FLX法分析了番茄叶片和果实 中的小分子RNA表达情况，结果表明: 番茄miR390 和 miR1917在果实中的表达量远高于在叶片中，而且 miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯 时表达量显著下调，因此认为这2个miRNA可能参与了番 茄果实的发育过程。
• 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
3.1.2 利用重测序技术鉴定突变体突变基因

临床医学技术培训PPT高通量测序与临床诊断

临床医学技术培训PPT高通量测序与临床诊断
肿瘤基因突变背景
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析

高通量测序技术及原理介绍ppt课件

高通量测序技术及原理介绍ppt课件

Bustard
• Base with highest corrected intensity is called
AC
G
T
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
C
Gerald
• Filtering removes low quality base calls
GEneration of Recursive Analyses Linked by
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
1-8 samples
Fragment DNA Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters Select ligated DNA
Hybridize to flow cell Extend hybridized oligos Perform bridge amplification
Solexa
Flow cell in GAIIx
Image re-analysis pipleline
Instrument PC
Images (.tif) Lane 1..8
Cycle 1..36
Tile_Cycle_Image_a, Tile_Cycle_Image_c, Tile_Cycle_Image_g, Tile_Cycle_Image_t

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍

Cluster generation: Bridge amplification
Bridge amplification cycle repeated till multiple bridges are formed
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation
高通量测序技术及原理介绍
童贻刚 军事医学科学院 微生物流行病研究所 tong.yigang@
14
公司
系统名
测序长度 优点
缺点
Roche/454 Illumina ABI/SOLiD Helicos
FLX System 200_700
HiSeq 2000/miSeq
Newly synthesized covalently attached to the flow cell surface.
Original template
discard
Newly synthesized
strand
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Covalently bound spatially separated single molecules
.params file
Analysis PC/cluster
data transfer
GA Analysis Pipeline
Image Analysis
Base calling
Sequence Analysis
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
For each tile:
Paired end sequencing

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

高通量测序技术应用测序技术推进科学研究的发展。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。

比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。

在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。

在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。

这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。

目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。

科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Hybridize fragment & extend
> 50 M single molecules hybridize to the lawn of primers
Bound molecules are then extended by polymerases
Adapter sequence
3’ extension
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Denature double-stranded DNA
Double-stranded molecule is denatured.
Original template is washed away.
Double-stranded bridge is denatured. Result: Two copies of covalently bound singlestranded templates.
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
高通量测序技术及原理介绍
tong.
公司 Roche/454 Illumina ABI/SOLiD Helicos
系统名 FLX System

高通量测序技术的类型原理及应用-ppt

高通量测序技术的类型原理及应用-ppt

纳米孔测序原理
概述
纳米孔测序技术利用电 场驱动DNA通过纳米孔， 通过检测电流变化来判 断DNA序列。
原理
DNA通过纳米孔时，不 同碱基对产生的电学信 号不同，根据信号差异 进行测序。
特点
单分子测序、实时检测、 便携式，适用于单分子 水平的基因组测序和变 异检测。
合成测序原理
概述
合成测序技术是通过连续添加碱基并检测产物来推断DNA 序列的技术。
特点
高通量测序技术具有高速度、高 准确性、高灵敏度、高通量和高 信息量等特点，能够快速获取大 量基因组序列信息。
高通量测序技术的发展历程
1977年
01
1986年
02
03
1990年
Sanger等提出DNA测序方法， 即双脱氧终止法，奠定了DNA测 序的基础。
Maxam和Gilbert提出另一种测 序方法，即化学降解法。
微生物多样性研究
高通量测序技术可以测定微生物群落的基因组序列，有助于研究微 生物多样性和生态学。
农业与动植物研究
作物育种与改良
高通量测序技术可以测定作物的基因组序列，为 作物育种和改良提供技术支持。
动物遗传资源保护
高通量测序技术可以检测动物的遗传变异，有助 于动物遗传资源的保护和评估。
生态学与进化研究
原理
合成过程中加入不同碱基的类似物，通过检测产物中特定 碱基的量来确定DNA序列。
特点
高精度、高分辨率、低成本，适用于基因组测序和SNP检 测。
光学图谱测序原理
概述
光学图谱测序技术利用光学显微镜和 分子标记技术对DNA进行定位和测
序。
原理
在DNA分子上标记荧光染料或量子 点等光学标记，通过光学显微镜观察

高通量测序流程和原理

高通量测序流程和原理

高通量测序流程和原理
高通量测序（High-throughput sequencing）是一种快速、高效的DNA测序技术，也被称为第二代测序技术。

它的出现极大地推动了基因组学和生物信息学的发展，为基因组变异、表达调控、蛋白质组学等研究领域提供了强大的支持。

高通量测序的流程可以简单概括为DNA提取、文库构建、测序仪测序和数据分析四个步骤。

首先是DNA提取，从样本中提取出所需的DNA，可以是基因组DNA、表达物的cDNA等。

接下来是文库构建，将提取的DNA片段连接到测序引物上，形成文库。

然后是测序仪测序，将文库中的DNA片段进行高通量测序，得到大量的原始测序数据。

最后是数据分析，对原始数据进行质控、比对、组装和功能注释等一系列分析，最终得到所需的生物信息学结果。

高通量测序的原理主要基于测序引物的引导下，通过不断地合成和检测新的核苷酸碱基，从而逐渐构建起整个DNA片段的序列。

常见的高通量测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序等，它们各自采用不同的原理和方法，但都能实现高通量的DNA测序。

在实际应用中，高通量测序技术被广泛应用于基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等领域。

它不仅在科学研究中发挥着重要作用，还在临床诊断、生物工程、农业育种等领域有着广阔的应用前景。

总之，高通量测序技术以其快速、高效、准确的特点，成为现代生物学研究中不可或缺的重要工具，为我们深入了解生命的奥秘提供了有力支持。

随着技术的不断进步和应用的不断拓展，相信高通量测序技术将为生命科学领域带来更多的惊喜和突破。

高通量测序技术原理

高通量测序技术原理

高通量测序技术原理
高通量测序技术是一种可以快速、高效地获取生物体基因组序列信息的方法。

其原理基于DNA的复制与扩增技术，通过将DNA样本分解成数百万份的碎片，并将这些碎片片段绑定到
固定位置上形成芯片或内含有大量微球的流式细胞，然后进行放大、测序和数据分析。

首先，DNA样本需要通过一系列预处理步骤进行准备，如提
取细胞DNA、打断DNA链、修复末端、连接链接器等。

接
下来，DNA样本被分解成许多小片段，每个片段的长度通常
在200到600碱基对之间。

这些片段被随机分布在芯片上的微阵列或微球上，并使用连接器将其固定在那里。

在扩增步骤中，每个DNA片段被扩增成数百万个拷贝，形成
一个小团簇。

这些团簇能够被形成的荧光探针识别，同时每个片段都要记录在芯片上的相应位置。

测序过程中，通过不同的技术方法，如Sanger测序、Illumina
测序、Pacific Biosciences测序或Oxford Nanopore测序，逐个
片段进行拷贝，其中一部分DNA链上的缺失碱基或化学修饰
会导致每个片段在特定位置结束。

数据分析过程包括对测序结果进行排序、拼接、比对和注释，生成完整的基因组或转录组序列。

高通量测序技术的主要优势在于可以在短时间内获得大量数据，
大大加速了生物学研究进程。

它广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学、疾病研究和新药开发等领域。

【完整】高通量测序原理资料PPT

【完整】高通量测序原理资料PPT
无需建库，自动化样品制备，简单；
序（de novo sequencing） 拼接带来困难 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
技术特色突出表现
• 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独 运行一个样品，也可以把多个样品混合在 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
• 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，
基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号减，读取序列较短，给从头测序（de novo sequencing） 拼接带来困难 移除其他未掺入的核苷酸
低，信号衰减，读取序列较短，给从头测 Solexa 的基本原理
• 4种标记过的核苷酸
O HN
ON
PPP
O
3’
保护基团
荧光基团
掺入 检测 去保护基团 去荧光基团
O
X
5’
HN
DNA O N
O
O
3’ OH 游离3‘末端
Next cycle
A
C G
T
C
A
T
G A
T
G
C
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
3’ 5’
T G C T A C G A T A C C C G A T C G A T
两端接上 adapters
循环扩增DNA片段成“DNA簇”
20 microns
Sequence
~1000 DNA片段per ~ 1 µm “DNA簇” ~1000 “DNA簇” per 100 µm square ~40 million clusters per experiment
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Surface bound adapter 1
Sequencing primer binding site
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Surface bound adapter 2
Flow cell
Surface of flow cell coated
with a lawn of oligo pairs
750bp 1000bp X 96
进化过程
15bp 30bp，50bp， 75bp，100bp 100bp，400bp 300bp，600bp
产出 30G 600G
0.7G 0.0001G
测序时间 10天 14天
7小时 2小时
15
Illumina workflow
❖Sample preparation
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
Perform sequencing on forward strand Re-generate reverse strand
Perform sequencing on reverse strand
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Sample Prep - Resequencing
8 channels
Key to the simplified workflow • Clonal clusters are
generated in a contained environment (need no clean rooms) • Sequencing also performed in the flow cell on the generated clusters
Single molecules bound to flow cell in a random pattern
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Bridge amplification
Single-strand flips over to hybridize to adjacent primers to form a bridge. Hybridized primer is extended by polymerases.
▪ Shearing, ligate adapter
❖Cluster generation
▪ Bridge PCR
❖Sequencing on Genome Analyzer IIx
▪ RTA (Run Time Analysis)
❖ Analysis pipeline
▪ Offline analysis, alignment, SNPs calling, reads counting
测序长度 200_700 2 x 150 25_35 25_30
优点 读长最长； 通量高 通量非常高
通量高；试 剂消耗少 通量高
缺点 同聚性错误；仪 器和试剂价格贵 价格贵；后期分 析复杂 读长太短
读长太短

测序平台 SOLiD Solexa Hiseq2000 454 3730
测序长度 30bp 150bp X 2
Newly synthesized covalently attached to the flow cell surface.
Original template
discard
Newly synthesized
strand
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Covalently bound spatially separated single molecules
1-8 samples
Fragment DNA Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters Select ligated DNA
Hybridize to flow cell Extend hybridized oligos Perform bridge amplification
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Hybridize fragment & extend
> 50 M single molecules hybridize to the lawn of primers
Bound molecules are then extended by polymerases
Adapter sequence
3’ extension
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Denature double-stranded DNA
Double-stranded molecule is denatured.
Original template is washed away.
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Bridge amplification
double-stranded bridge is formed.
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation: Bridge amplification
高通量测序技术及原理介绍
童贻刚 军事医学科学院 微生物流行病研究所 tong.yigang@
公司 Roche/454 Illumina ABI/SOLiD Helicos
系统名 FLX System
HiSeq 2000/miSeq 5500xl SOLiD HeliScope