DHA的来源及寇氏隐甲藻生产DHA的研究

收稿日期:2011-05-12作者简介：姜剑锋（1984-），男，湖北武汉人，内蒙古农业大学硕士研究生，主要从事微生物油脂研究。通讯作者：何东平（1957-），男，湖北武汉人，教授，博士,博士生导师，研究方向为微生物油脂与植物蛋白。1DHA的结构和功能1.1DHA的结构DHA，中文称之为二十二碳六烯酸，英文名Docosahexaenoicacid（简称DHA，下同），化学名称为二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸（全顺式），简记为C22:6(ω-3)，属ω-3（n-3）系列长链多不饱和脂肪酸。1.2DHA的功能1.2.1健脑益智———人体“脑黄金”DHA是人体大脑的主要组成成分之一，主要以磷脂的形式存在，约占脑细胞脂肪酸的10%左右。在胎儿时期，DHA必须从母体获得，妇女在怀孕期间，如果DHA摄入量不足，会导致胎儿的脑细胞生长和发育不正常，严重的会产生弱智。在婴幼儿时期，大脑处于生长发育阶段，研究表明，饮食中含DHA丰富的婴儿，思维比一般的婴儿更加敏捷，语言能力和学习能力也较对照组高，患神经系统疾病（如神经官能症）的几率也低得多。青少年学生，由于学习任务繁重，多摄入DHA，可以增强记忆力、改善注意力等。对成年人来讲，DHA也是维持功能发挥必不可少的物质，特别是脑力劳动者和中老年人，如果DHA摄入不足，则大脑功能会降低，会出现注意力不集中、心情抑郁和效率低下等状况，更严重的可能会导致老年痴呆症。1.2.2预防和治疗心血管疾病DHA具有抗凝血、抑制血小板凝集和血栓形成,从而预防心肌梗塞等心血管疾病的发生。Mori等人指出，DHA具有降血压的功能，并且可以调节人体内血脂和脂蛋白的正常代谢，降低血液粘稠度和血液中胆固醇水平，增加高密度脂蛋白含量。日本的科学家指出，DHA可有效抑制血栓的形成，起到防止心血管疾病发生的作用。Siscovick等人指出，心脏病患者每日进食DHA，可以有效降低心脏猝死的几率。1.2.3保护视力DHA在人的视网膜中含量丰富，是视网膜组织的重要组成成分。实验证明，在食物中加人一定量DHA，有助于婴儿眼睛的发育，婴儿视觉发育和功能也要成熟得早一些，且他们比普通儿童的视觉灵敏；长期缺乏DHA，则视力会降低，这主要由于DHA能促进视神经膜延伸和维持视觉正常功能有关。1.2.4抗癌作用DHA有抑制癌症的作用，能明显抑制肿瘤的发生，成长和转移。大量临床和实验研究表明，ω-6系列长链不饱和脂肪酸对癌细胞的发展具有促进作用，而ω-3系列长链不饱和脂肪酸在体内与ω-6系列长链不饱和脂肪酸形成竞争性吸收，对癌症有抑制作用，ω-3与ω-6不饱和脂肪酸的比率对控制癌细胞的发展是一个重要的指标。此外，DHA还具有消炎、提高免疫力等作用。DHA的来源及寇氏隐甲藻生产DHA的研究姜剑锋1,2,4，赵丽芹1，陈涛2,3，何东平2,4(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018；2.湖北百信食品有限公司研发中心，湖北武汉430040；3.中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉430071；4.武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉430023)摘要：DHA（二十二碳六烯酸）在婴幼儿大脑发育和视力发育中具有非常重要的生理作用，并且具有防治心血管疾病，提高人体免疫力和消炎、抗癌等功能。DHA的来源有多种，在寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)的细胞油脂中，DHA的含量高达30%~50%，而其他多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量较少，寇氏隐甲藻可以在添加了有机底物的培养基中高密度发酵，是人体补充DHA的良好来源。关键词：DHA；寇氏隐甲藻；研究进展中图分类号:Q547文献标识码:A10.3969/j.jssn.1007-0907.2011.03.058文章编号:1007-0907(2011)03-0109-04TheResearchDevelopmentofDocosahexaenoicAcidProductionbyCrypthecodiniumCohniiJIANGJian－feng(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2.InvestigationCenter,HubeiPashunFoodsCO.LTD,Wuhan430040,China;4.CollegeofFoodScienceandEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)Abstract：DHAisapolyunsaturatedfattyacidthatbelongstotheω-3group.Inrecentyears,DHAhasattractedmuchattentionbecauseitplaysanimportantroleinhumanhealth.CrypthecodiniumcohniiisextraordinaryinDHAanditcanbegrownheterotrophicallyonorganicsubstrateswithoutlight.ItisaprolificproducerofDHA.ThispaperreviewsrecentadvancesinthebiotechnologicalproductionofDHAbyC.cohnii.Keywords：Docosahexaenoicacid(DHA)；Crypthecodiniumcohnii；Researchdevelopment内蒙古农业科技2011（3）：109~112InnerMongoliaAgriculturalScienceAndTechnology2DHA的来源从目前的情况来看，DHA的现实和潜在来源主要包括有鱼油加工产品、海洋微藻类及某些真菌类等。2.1鱼油鱼油是DHA的传统来源，鱼油是指从鱼或鱼加工的下脚料中制取的油脂，DHA含量较高的鱼油主要从含ω-3长链不饱和脂肪酸较高的海洋鱼类，特别是中上层鱼类中获得。鱼油因其成本较低、价格便宜，在食品工业中早有广泛的应用。可是英国科学家Jacobs等人的研究报告指出：海洋鱼类的体内积累大量的持续性有机污染物（PersistentOrganicPollutants，缩写为POPs），其危害多年来一直被人们所忽视。在海洋环境中，POPs可通过食物链在不同级别的生物中进行累积，而鱼在海洋食物链中占有较高的地位，其体内可累积不同种类的持续性有机污染物。由于这些污染物多是脂溶性物质，在海鱼脂肪组织中有大量的积累，所以提取的鱼油中不可避免的含有一定量的POPs，不利于身体健康。且鱼油中高的EPA含量会导致孕妇有大出血倾向和抑制儿童的正常发育。2.2海洋微藻实际上，深海鱼油的DHA正是从海洋微藻通过食物链的富集作用而来。蒋霞敏等人在对多种海洋微藻的培养和脂肪酸组成的分析测定表明，湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻、定鞭金藻、等鞭金藻、绿色巴夫藻，中肋骨条藻、三角褐指藻、牟氏角毛藻、新月菱形藻体内均含不同浓度的DHA，某些藻类，如透明前沟藻、卵圆旋沟藻的DHA甚至达到30%以上。利用微藻发酵生产DHA不仅可以弥补鱼油资源的不足，而且与传统鱼油相比，微生物油脂具有脂肪酸组成简单，分离纯化工艺简单，不含鱼腥味，适宜做食品添加剂，利用率高和易工业化生产等优点以及巨大的健康优势，微生物发酵法生产DHA正成为目前研究的一个热点，藻油成为国际市场的宠儿，广泛应用到婴幼儿奶粉、高端食品和保健品等方面。2.3其他微生物研究表明，某些海洋细菌和一些真菌也含有DHA，其中以藻状菌类的含量尤为丰富。吴克刚（2003）在研究植物激素对破囊壶菌的作用时发现，破囊壶菌体内DHA含量可占总脂肪酸含量的70%以上，是DHA的潜在来源。3寇氏隐甲藻生产DHA的研究进展3.1栖息地自然条件下，隐甲藻多以一个物种综合的形式出现，他包括许多孤立的相似种。Himes等人的研究发现，寇氏隐甲藻分布广泛，海洋、红树林、污染了的含盐的河流和湖泊，甚至冰冻的港湾都是其栖息地，然而，不同研究人员从不同地区分离纯化出来的寇氏隐甲藻藻种不尽相同。3.2形态特征甲藻(dinoflagellate)是海洋中一类重要的浮游植物，它们属于真核生物，但保留着一些原核特征，并且具有一些特殊的特征。是介于原核生物和真核生物之间的中间过渡类型。寇氏隐甲藻（Crypthecodiniumcohnii）可以有两种存在形式：游动细胞和孢囊。游动细胞有两条鞭毛：一条水平鞭毛和一条侧生鞭毛。水平鞭毛全部或部分环绕在藻细胞的横沟上，提供细胞游动的推进力，侧生鞭毛沿着纵沟方向生长，在细胞游动时起操控作用，游动细胞自然条件下能以每年1km的速度移动。孢囊形式的细胞是卵球形的，可用在环境条件恶劣时通过休眠存活下来，孢囊形式的寇氏隐甲藻比游动形式的具有更高的油脂含量和DHA含量。刘小玲等人在对寇氏隐甲藻细胞超微结构的研究发现，在自由游动时期，寇氏隐甲藻细胞外面有一层包囊，表面不光滑，而当细胞进行有丝分裂时，没有包囊，细胞表面光滑，细胞变圆。3.3培养条件3.3.1温度温度对微藻的培养具有重要的影响：一方面，温度影响微藻的生长速率；另一方面，温度影响藻细胞内油脂脂肪酸组成和含量的变化。姜锐和陈峰等人（2000）的研究指出，温度在15~30℃，寇氏隐甲藻都能良好的生长，而当温度低于14℃或高于31℃时，生长会受到抑制。3.3.2光照强度光是微藻培养中影响其生长及生化成分变化的最重要的因子之一。有实验表明，增加光强能够促进脂肪酸含量的增加，然而，更多的研究显示，生长在高光强下的微藻，其不饱和脂肪酸的比例降低，国内学者对三角褐指藻和小球藻、后棘藻、微结球藻等的研究中发现PUFA含量随光强增加而呈下降趋势。所以，光强与脂肪酸含量之间的关系因种而异，并非全都一致。3.3.3氧气寇氏隐甲藻是专性需氧型微生物，氧气的充足供应是获得高的生物量的前提。在摇瓶培养状况下，氧气一般是充足的；而在生物反应器中，需要通入一定量的空气以保证氧的供给。3.3.4pH值姜悦发现，当pH值＜3.96或pH值＞9.75时，寇氏隐甲藻基本不生长；当pH值为6.76是最有利于细胞的生长；而在pH值6.0~7.2，有利于油脂的积累。不同的人对寇氏隐甲藻的最适pH值研究结果表明，藻株不同，寇氏隐甲藻的最适pH值也略有差异。3.4培养基3.4.1碳源微藻培养基常用的碳源有葡萄糖、醋酸（盐）和乙醇等。王永华等研究发现，寇氏隐甲藻较难利用蔗糖、麦芽糖、甘露糖，可以利用葡萄糖、醋酸钠、糖蜜。醋酸钠有利于DHA的积累，但不利于油脂的积累；葡萄糖作为碳源，不仅可以获得较高的油脂产量，而且DHA含量也较高，达到1548mg/L的水平。而Swaaf等研究了葡萄糖、醋酸和乙醇作为碳源，DHA的生产力分别达到19mg/L·h、48mg/L·h和53mg/L·h，53mg/L·h也是迄今报道过的最高的DHA产量。但葡萄糖是工业生产中一种最为常用的碳源。3.4.2氮源王菊芳等的研究表明：胰蛋白胨和蛋白胨对藻体的生长和DHA积累有利；寇氏隐甲藻也可以利用NO3－，但不能利用NH4+。在保持总含氮量不变的前提下，蛋白胨和硝酸盐的含氮量之比为1∶2时，达到最大的生物量和DHA产量。而王永华的研究表明，酵母膏是寇氏隐甲藻的理想氮源，当酵母膏和硝酸钾的比例为1∶2时，寇氏隐甲藻的生物量、油脂产量和DHA产量都达到最大。110内蒙古农业科技No.33.4.3碳氮比碳氮比对寇氏隐甲藻的脂肪酸组成有重要影响。试验表明：在碳氮比为6~31的范围内，随着碳氮比的提高，大生物量和DHA在总脂肪酸的含量呈下降趋势；在碳氮比为21时，油脂含量最低；而在碳氮比为11时，DHA的产量最高。3.4.4无机盐自然条件下，寇氏隐甲藻生长在海水中，因此模拟海水和寻找合适的无机盐浓度对寇氏隐甲藻的培养具有重要意义。王永华等研究发现得出，寇氏隐甲藻发酵生产DHA的最佳无机盐浓度为：0.9g/L的氯化钠、0.8g/L的磷酸二氢钾和12mmol/L的Mg2+，此时，DHA的产量最高。此外，低浓度的镧和钕对寇氏隐甲藻的生长具有弱的刺激作用，而当浓度大于90mg/L时，具有强的抑制作用。而祁秋霞的研究表明，硫酸铜对海洋微藻的生长具有抑制作用，对于不同种类的微藻，硫酸铜抑制其生长的最低浓度也不同。3.5油脂的提取及分离纯化3.5.1油脂的提取从微藻中提取油脂通常采用溶剂法，包括正己烷（或6号溶剂）浸提法、Folch法等方法，溶剂浸提法存在时间长、效率低、溶剂残留等问题。超声波不仅可以降低提取温度、缩短提取时间、降低溶剂用量，更能使DHA的提取率升高。超临界CO2萃取技术是近些年来研究较多的一种新技术。胡爱军等分别用溶剂法(SE)、超声波法(USE)、超临界CO2萃取法(SFE)及超声强化超临界CO2萃取法(USFE)对微藻中的DHA进行了提取，通过分析发现，超声波对超临界CO2萃取也具有促进作用，它降低了超临界CO2萃取的萃取压力，并缩短了萃取时间，而且DHA的萃取率也明显提高。而过群的一项专利表明，运用生物酶技术，对寇氏隐甲藻进行破壁，可以避免油脂的氧化、缩短油脂的提取时间和提高提取率。3.5.2油脂的分离纯化DHA的分离纯化方法很多，归纳起来，主要有分子蒸馏法、尿素包合法、低温结晶法、超临界流体萃取法、吸附分离法、膜分离法、脂肪酶浓缩法、柱色谱法及上述两种或两种以上方法复合法等。参考文献：[1]王永华.隐甲藻高密度发酵培养和油脂改性研究[D].广州:华南理工大学,2002.[2]JorgensenMH,HughesEL,MichaclsenKF,IsThereaRelationbetweenDecosahexaenoicAcidConcentrationinMothersMilkandVisualDevelopmentinTermInfants[J].JournalofPediatricGastrienologyandNarration,2001,(32):293-296.[3]CarlsonSE,WerkmanSHArandomizedtrialofvisualattentionofpreterminfantsfeddocosahexaenoicaciduntiltwomonths[J].Lipids,1996,31(1):85－90.[4]SmiteN,BreastMilkDocosahexaenoicAcid(DHA)CorrelateswithDHAStatusofMalnourishedInfants[J].ArchievesofDiseaseinChildhood,2002,82(6):493-494.[5]WerkmanSH,CarlsonSEArandomizedtrialofvisualattentionofpreterminfantsfeddocosahexaenoicaciduntilninemonths[J].Lipids,1996,31(1):91－97.[6]SoderbergM.FattyacidcompositionofbrainphospholipidsinagingandinAlzheimer’sdisease[J].Lipids,1991,(26):421－425.[7]MoriTA,BaoDQ,BurkeV,eta1.DocosahexaenoicAcidButNotEicosapentaenoicAcidLowersSmbulatoryBloodPressureandHeartRateinHumans[J].Hypertension,1999,(34):253-260.[8]UmemuraK,ToshimaY,AsaiF,etal.EffectofDietaryDocosahexaenoicAcidinTheRatMiddleCerebralarteryThrombosisModel[J].ThrombosisResearch,1995,78(5):379-387.[9]SiscovickDS.Dietary-intakeandCell-membraneLevelsofLong-chainN-3PolyunsaturatedFattyAcidsandTheRiskofPrimaryCardiac-arrest[J].JournaloftheAmericanMedicalAssociation.1995,274(17):1363-1367.[10]AuestadN.Visualacuity,erythrocytefattyacidcomposition,andgrowthinterminfantsfedformulaswithlongchainpolyunsaturatedfattyacidsforoneyear[J].PediatrRes,1997,41(1):1－10.[11]董伟，陈泮藻.ω-3多不饱和脂肪酸与炎性疾病[J].中国海洋生物,1997,(4):34－39.[12]JacobsMN,CovaciA,SchepensP.InvestigationofselectedpersistentorganicpollutantsinfarmedAtlanticsalmon(Salmosalar),salmonaquaculturefeed,andfishoilcomponentsofthefeed[J].EnvironmentalScience&Technology,2002,36(13):2797-2805.[13]VetterW,StollE.Qualitativedeterminationofbioaccumulativehalogenatednaturalproductsinfoodandnovelfood[J].EuropeanFoodResearchandTechnology,2002,(215):523-528.[14]蒋霞敏，郑亦周.14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究[J].水生生物学报,2003,27(3):243-247.[15]曾名勇.EPA和DHA的来源和分离[J].渔业机械仪器,1995,(4):17-19.[16]吴克刚，柴向华，杨连生.植物激素对破囊壶菌生长与产DHA的影响[J].微生物学报,2003,43(1):111-115.[17]BeamCA,HimesM.DistributionofmembersoftheCryythecodiniumcohnii(Dinophyceae)speciescomplex[J].Protozool,1982,(29):8-15.[18]BhaudY,SalmonJM,Soyer-GobillardMO.Thecomplexce11cycleofthedinoflagellateprotoctistCrypthecndiniumcnhniiasstudiedinvivoandbycytofluorimetry[J].CellSci,1991,(100):675-682.[19]刘晓玲，沈延，翟中和.一种原始真核细胞———寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)超微结构的特殊性[J].电子显微学报,1999,18(6):579-583.[20]JiangY,ChenF.EffectsoftemperatureandtemperatureshiftondocosahexaenoicacidproductionbythemarinemicroalgaCrypthecndiniumcnhnii[J].JAmChemSoc,2000,(77):613-617.[21]廖启斌，李芊，李文权，等.光辐射对海洋微藻脂肪酸含量的效应[J].海洋技术,2002,21(1):46-48.[22]徐年军，张学成.温度、光照、pH值对后棘藻生长及脂肪酸含量的影响[J].青岛海洋大学学报,2001,31(4):541-547.[23]蒋霞敏.温度、光照、氮含量对微绿球藻生长及脂肪酸组成的影响[J].海洋科学,2002,26(8):9-13.[24]JiangY,ChenF.EffectsofmediumglucoseconcentrationandpHondocosahexaenoicacidcontentofheterotrophicCrypthecodiniumcohnii[J].ProcessBiochem,2000,(35):1205-1209.[25]王永华，梁世中，杨博.碳、氮源对隐甲藻油脂和DHA积累的影响[J].中国油脂,2001,36(6):58-60.[26]deSwaafME,PronkJT,SijtsmaL.Fed-batchcultivationofthedocosahexaenoic-acid-producingmarinealgaCryythecndiniumcnhniionethanol[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,(61):40-43.3期姜剑锋等：DHA的来源及寇氏隐甲藻生产DHA的研究111