分子杂交和印迹技术共57页文档

➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
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3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
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3、Western 印迹杂交
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3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
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2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
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4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
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4、原位杂交（in situ hybridization）
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2、分子印迹（blot、bloting）

数据分析
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点
阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反 应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理 蛋白质分子间的亲和反应
干姜附子肉桂造模的血清细胞因子芯片检测（L Series 90: RayBio® Labelbased Rat Antibody Array ，货号：AAR-BLM-1-2 ） Normal
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼 龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场
的作用下横向转移到正
胶
膜
极一侧的膜上。
蛋白
Western装置
② Blotting
PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 维素膜
待测蛋白 一抗 二抗
多克隆抗体 Blotting的结果
基因芯片及数据分析
一、基因芯片的技术原理 二、基因芯片的点制过程 三、基因芯片的数据分析
基因芯片
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
芯片杂交操作流程：
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 用机悈手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定。 分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成
基本程序（1）细胞或组织固定及切片 （2） 预杂交及杂交（3）冲洗 （4）放射自显影或 标记酶显色
原位杂交的原理

• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
NL不具备) －－结合能力较NC膜低 －－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。 （1）物理吸印方法
原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要 因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重 要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋 白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一 种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需 要进一步完善和提高 用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以 是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则 杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～ 30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于 长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA 探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探 针。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE 配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
固相核酸分子杂交类型



Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置

的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
.
四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝
数及表达丰度。
.
第二节 核酸分子杂交的方法
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
为
1 2
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
二、分子杂交
• 将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核 酸分子放入同一个反应体系，两条互补链 可通过复性重新缔合形成双链，这一过程 成为核酸分子杂交。
.
三、探针
探针：是指带有标记物的、能与被检测
的核酸片段互补的一段已知核酸片段。
.
酶促标记法 1.切口平移法（nick translation)
1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
.
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
.
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
.
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3

RNA提取
RNA变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交
RNase 具有活性高，不 易灭活 抑制RNase活 性
所有的试剂和器皿都 必须进去除RNase 处理！！
变性处理：甲醛、乙二醛
破坏RNA二级结构
洗膜
放射自显影或化学显色
基本步骤
1. RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转 移至硝酸纤维素滤膜上。 2. 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱 于80℃干燥0.5-2小时。 3. 预杂交，时间为1-2小时。 4. 杂交 过夜 5. 洗膜 6. 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于70℃曝光24-48小时。

Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主 要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构， 保证RNA 完全按分子大小分离。

变性电泳主要有3 种:
甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳
羟甲基汞变性电泳

电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相 同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上, 然后与探针杂交。
3. 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物 质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐 减弱的原理，可以设置一定的屏障物来 进行防护。常用的材料有水、砖、大理 石、混凝土、重金属铅等。
32P
有机玻璃版 铅衣
4. 利用衰变：可利用放射性物质存在自发 衰变，其活性随之减少的原理进行外照 射防护。如：半衰期小于15天的放射性 废物，允许放置10个半衰期后作一般废 物处理。
注意事项 1. DNase I的量 2. dNTP a-P 3. 温度4-16℃
Pol I DNase I
两条链都可 被标记
随机引物合成法

第三十五页，共68页。
标记物种类
• 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物
半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体
荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等
化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，
如生物素酰化的碱性磷酸酶
可使发光底物发光
第三十六页，共68页。
（三）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
第一页，共68页。
二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件 下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已 知核酸序列称探针。
凝胶中的缓冲液41固相支持物的选择1理想的固相支持物应具备的特性具有较强结合核酸分子的能力不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应与核酸分子结合稳定牢固具有良好的机械性能?非特异吸附少42常用的固相支持物硝酸纤维素膜尼龙膜化学活化膜43southern印迹的常用方法1毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用将凝胶中的dna转移到固相支持物上
第四十四页，共68页。
四、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度：
浓度越大，复性速度越快
分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加
双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg，浓度过高影响杂 交效率
第四十五页，共68页。
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃
第二十六页，共68页。
第二十七页，共68页。

单链探针
用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性 基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补 链的干扰。
2020/10/17
ppt课件
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2．RNA探针
与 DNA 单 链 探 针 相 比 ， RNA 探 针 具 有 标 记 效 率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点
➢早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针
不影响碱基配对的特异性与稳定性 灵敏度和特异性极高 对各种酶促反应无任何影响
放射性污染
半衰期短, 随用随标
ppt课件
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r-32P ATP
a-32P dATP
*
*
3’ 2’ H
dATP
32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，
灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。
缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放
核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid hybr指id具iz有a一ti定on互)补序列、不同来源的核苷酸单链，
在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷 酸双链的过程。
Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象 是核酸杂交技术的理论基础。
2020/10/17
ppt课件
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(heteroduplex)
2020/10/17
ppt课件
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DNA随机引物标记法示意图
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46=4096
DNA 聚 合 酶 ⅠKlenow片段：保留 5’→3’ DNA聚合酶活 性 , 弱 3’→5’ 外 切 酶 活性，无5’→3’外切 酶活性。
2020/10/17
ppt课件
与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。

（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
• 又称为Western杂交，或免疫印渍技 术，即利用抗原-抗体反应，检测转移 到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 • 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
FISH（fluorescence in situ hybridization）技 术是一种重要的非放射性原位杂交技术。 它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二 者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核 酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子 如生物素、地高辛，可利用该报告分子与 荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学 反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。
原位杂交 in situ hybridization
• 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。 • 因此原位杂交可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置，这一点具有重 要生物学和病理学意义。
原位杂交(in situ hybridization)
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
• 又 称 为 Southern 杂 交 ， 即 DNA-DNA 杂交分析，是研究 DNA 图谱的基本技 术，主要用于基因组 DNA 的分析，如 在基因组中特异基因的定位及检测等， 在遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物 分析等方面有重要价值。

2018年12月18日4时6分 18
(3) DNA的末端标记 1) DNA的3′末端标记
5′ 3′ 限制性内切酶 3′ 3′ 5′
DNA 聚合酶ⅠKlenow 片 段 ： 保 留 5 ’→ 3 ’ DNA 聚 合 酶 活 性 , 弱 3’→5’ 外切酶活性， 无 5’→3’ 外切酶活性。
2018年12月18日4时6分 17
优点：
Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定， 可以获得大量的有效探针；
对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模 板也可进行反应； 产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针； 随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。
术就可以显现杂交分子的有无和位置。
2018年12月18日4时6分 5
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作
（4）基因突变分析
（5）疾病的诊断
2018年12月18日4时6分 6
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念：
用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列 的DNA或RNA的互补标记片段： 与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。
2018年12月18日4时6分 14
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链 DNA 上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5 ’→ 3 ’ DNA 聚合酶活性； 5 ’→ 3 ’ 外 切 核 酸 酶活性。
2018年12月18日4时6分 15
2018年12月18日4时6分 3
一、印迹技术(blotting)
指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定 化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。

NL不具备)
－－结合能力较NC膜低
－－活化过程较复杂 4)绍和分子杂交技术分析
转膜
是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。
（1）物理吸印方法
（毛细虹吸 真空抽吸）
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相核酸分子杂交类型
Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ
Northern Blot－－RNA （Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为 Northern印迹。）
Western Blot－－Protein（immunoblotting) （1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装
置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为 Western印迹，这装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低 电压完成转移。）
－－杂交本底较高分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
3) 化学活化膜（chemical activated membrane）
将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜 （如ABM和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处 理而活化，产生活化基团（重氮盐）与DNA或RNA分子 共价结合。
• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、