Northern印迹杂交技术教案资料

Northern杂交试验指导手册Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。

贮存液室温保存备用（不超过3个月）。

工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。

工作液于室温下保存不超过1个月。

工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。

2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。

3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。

4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。

5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。

6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。

Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交A．探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。

如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。

在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。

探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。

取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。

在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。

B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。

C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml于-20℃保存。

northern印迹法原理和流程英文回答：The Northern Blot technique is a widely used method for detecting the presence of a specific RNA molecule in a sample. The principle behind this technique is to separate RNA molecules based on their size using gel electrophoresis and then transfer them onto a membrane for hybridization with a labeled probe. The labeled probe will bind to the specific RNA molecule of interest, allowing for its detection and quantification.The Northern Blot technique involves several key steps. First, RNA is extracted from the sample of interest, typically using a method such as phenol-chloroform extraction. The extracted RNA is then separated by size using gel electrophoresis, which involves applying an electric field to the gel matrix to separate the RNA molecules based on their size. The separated RNA molecules are then transferred from the gel onto a membrane,typically a nylon membrane, through a process called capillary or vacuum transfer.After the transfer, the membrane is cross-linked to immobilize the RNA, making it available for hybridization with a labeled probe. The labeled probe is a single-stranded DNA or RNA molecule that is complementary to the target RNA of interest. This probe is typically labeled with a radioactive or fluorescent tag for detection. The membrane is then incubated with the labeled probe, allowing it to hybridize specifically to the target RNA molecule.Following hybridization, the membrane is washed to remove any unbound probe, and then it is exposed to X-ray film or scanned using a fluorescent scanner to visualize the labeled RNA molecule. The intensity of the signal on the film or scanner corresponds to the abundance of the target RNA molecule in the original sample.Overall, the Northern Blot technique provides a valuable tool for studying gene expression and RNA abundance in biological samples.中文回答：北方印迹法是一种用于检测样本中特定RNA分子存在的常用方法。

Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。

实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。

探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。

所需试剂和耗材：1.RNA样品或mRNA样品。

2.探针模板DNA。

3.尼龙膜。

4.NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。

实验仪器：1.恒温水浴箱。

2.电泳仪。

3.凝胶成像系统。

4.真空转移仪和真空泵。

5.UV交联仪。

6.杂交炉。

7.恒温摇床。

8.脱色摇床。

9.漩涡振荡器。

10.分光光度计。

11.微量移液器。

12.电炉或微波炉。

13.离心管。

14.烧杯。

15.量筒。

16.三角瓶等。

准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。

2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。

3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。

4.使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。

实验方法：1.将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。

2.将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。

3.将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。

4.通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。

5.对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。

6.通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。

7.根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。

注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。

2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。

northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。

它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。

北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。

北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。

北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。

首先，从细胞或组织中提取总RNA。

通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。

在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。

接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。

在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。

然后，固定RNA到膜上。

这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。

可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。

在固定RNA后，开始进行杂交。

杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。

探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。

探针的选择应根据研究的具体目的来确定。

杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。

温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。

杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。

最后，进行检测。

检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。

如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。

如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。

北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。

它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。

它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。

northern印迹杂交操作步骤标题：Northern印迹杂交技术的操作步骤详解Northern印迹杂交是一种研究基因表达的分子生物学技术，主要用于检测细胞中特定mRNA的存在和数量。

其基本原理是利用核酸之间的碱基配对原则，将放射性或非放射性的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行杂交，然后通过显影、放射自显影或者化学发光等方式显示结果。

以下是Northern印迹杂交的基本操作步骤：1. RNA的提取：首先从待测样本中提取总RNA。

常用的RNA提取方法有酚氯仿法、Trizol法等。

提取后的RNA需要进行定量和质量检查，以确保后续实验的准确性。

2. RNA的电泳分离：将提取到的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。

根据RNA的大小不同，会在凝胶上形成不同的条带。

通常情况下，28S rRNA的迁移速度比18S rRNA慢，因此可以根据这两个条带的位置和强度来判断RNA的质量。

3. RNA的转移：将电泳分离后的RNA通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。

这个过程称为“转膜”。

转膜时需要注意的是，硝酸纤维素膜的正反两面不能混淆，因为转膜后要进行的杂交反应只在膜的一面上进行。

4. RNA的固定：转膜后的RNA需要被固定在硝酸纤维素膜上，防止其在后面的杂交过程中脱落。

常用的固定方法是在高盐溶液中进行热处理。

5. 杂交：将标记好的DNA探针与固定的RNA进行杂交。

杂交过程一般在恒温水浴中进行，温度应设定在Tm值以下5℃左右。

杂交的时间视探针的长度和浓度而定，一般为过夜。

6. 洗脱：杂交后的硝酸纤维素膜需要进行洗涤，目的是洗去未与RNA杂交的游离探针。

常用的洗涤液是SSC缓冲液，洗涤次数视具体情况而定。

7. 显影：将洗涤后的硝酸纤维素膜用X光片覆盖，并放置在暗盒中曝光一段时间，然后进行显影。

如果使用的是放射性标记的探针，则需要进行放射自显影；如果是非放射性标记的探针，则可以采用化学发光的方式进行显影。

总的来说，Northern印迹杂交是一种相对传统的分子生物学技术，虽然操作步骤较为繁琐，但因其能够直接反映mRNA的存在和量的变化，因此在基因表达的研究中仍具有重要的地位。

northern印迹杂交原理北方印迹杂交是一种分离和分析DNA的方法，通常用于分离和分析基因组和DNA样品的特定序列。

这种方法基于DNA的电泳运动和杂交化学，使得DNA序列的特定区域可以被形成的杂交分子所识别和捕获。

在这篇文章中，我们将探讨北方印迹杂交的原理和应用。

一、北方印迹杂交的基本原理北方印迹杂交的过程可以被分为以下几个步骤：1. DNA提取：从样品中提取出所需DNA序列。

2. DNA切割：使用限制性内切酶将DNA切割成所需的片段。

3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将DNA片段通过凝胶电泳进行分离。

4. DNA转移：使用电泳将DNA分离到含有纤维素醇和盐的膜上。

5. DNA杂交：在膜上加入标记了所需DNA序列的探针，使其与目标DNA序列形成杂交。

6. 暴露于X光片：将膜暴露在X光片上，使得探针与目标DNA序列形成的杂交分子被记录下来。

由于DNA的电泳运动特性，分离的DNA片段可以根据其分子量在凝胶上定位，这使得这种方法可以大规模分析DNA样品中特定的序列。

而加入标记的DNA探针可以识别特定的目标DNA序列，从而使得这种方法具有很高的专业性和灵敏性。

二、北方印迹杂交的应用北方印迹杂交主要用于以下几种应用：1. 分析基因表达：通过北方印迹杂交可以分离出RNA序列，从而分析某个基因是否被表达和其表达的水平。

2. 检测基因突变：通过北方印迹杂交可以检测DNA序列中的特定突变，从而判断某一基因是否存在突变表达。

3. 确定DNA序列：通过北方印迹杂交可以进一步分析和确定DNA 序列中的某些特定区域。

总之，北方印迹杂交是一种比较常用的分子生物学方法，其原理简单，操作方便，可以用于基因表达和突变检测等多种应用。

在人类基因组研究和分析中有着广泛的应用价值。

northern印迹杂交操作步骤
Northern 印迹杂交是一种用于检测 RNA 的技术，以下是一般的 Northern 印迹杂交操作步骤：
1. RNA 提取：从样品中提取 RNA，可以使用适当的 RNA 提取方法，如苯酚-氯仿提取或商业化的 RNA 提取试剂盒。

2. RNA 质量评估：通过琼脂糖凝胶电泳或分光光度计等方法，评估 RNA 的完整性和浓度。

3. RNA 变性：将 RNA 样品在加热的缓冲液中进行变性，使其变成单链形式。

4. 凝胶电泳：将变性的 RNA 样品加载到琼脂糖凝胶上进行电泳，根据 RNA 的大小分离不同的 RNA 分子。

5. 转膜：将电泳后的 RNA 转移到固相支持物上，通常使用硝酸纤维素膜或尼龙膜。

6. 杂交：将带有 RNA 的膜与放射性或荧光标记的探针进行杂交，探针是与目标 RNA 互补的核酸序列。

7. 洗膜：在杂交后，进行洗膜步骤，以去除未结合的探针，降低背景信号。

8. 信号检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测杂交信号，并进行图像分析。

9. 数据分析：根据杂交信号的强度和分布，分析 RNA 的表达水平和特异性。

需要注意的是，Northern 印迹杂交是一项技术要求较高的实验方法，操作过程中需要严格控制实验条件和避免 RNA 的降解。

此外，探针的设计和选择也对实验结果有重要影响。

在进行 Northern 印迹杂交实验之前，建议详细阅读相关的实验方案和参考文献，并根据具体的实验需求进行适当的优化和改进。

如果你对具体的实验操作有更详细的问题，建议参考相关的实验手册或向专业的实验室技术人员咨询。

希望这些信息对你有所帮助！如果你还有其他问题，欢迎随时提问。

Northern blot技术-1核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot )(一)Southern Blot 原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…(一)Southern Blot原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途:检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

(二)Northern Blot原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。

(三)探针标记技术1 标记物:放射性和非放射性两种放射性:非放射性:生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法(1)切口平移法(2)随机引物法(3)末端标记法(4)单链DNA探针标记(5)寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。

Northern杂交实验步骤第17章 Northern杂交技术Northern杂交技术（Northern blot）是一种用于检测分析RNA 的核酸杂交技术，因为其基本原理和操作过程与Southern blot十分类似，所以称为Northern blot。

常用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

17.1主要内容1. Northern Blot方法的原理和操作步骤。

2. RNA琼脂糖凝胶电泳。

3. RNA转移至硝酸纤维膜及膜处理。

17.2目的要求掌握Northern blot方法的原理和操作步骤；掌握RNA电泳，RNA转膜及膜处理方法。

17.3实验原理在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交、显色检测，以确定待检RNA样品中是否含有目的基因的转录产物（mRNA）及其含量。

17.4材料、试剂及器材17.4.1材料、试剂1.总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(至少25ng)，DIG Easy Hyb杂交液(Roche公司)，10×nucleotide mix (10mmol/L each dA TP, dGTP, dCTP , DIG-11-dUTP)，琼脂糖，DEPC，Random Primer，KlenowⅠ酶，SDS，双氧水，DEPC处理水；EDTA (0.2mol/L pH 8.0)，RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)。

2.试剂配制：1) 5×MOPS: 0.1mol/L MOPS，0.04mol/L NaAc，0.005mol/L EDTA。

使用时用DEPC水稀释5×倍使用。

在400ml的DEPC水中溶解10.46g MOPS，用HAc或NaOH 调节pH至7.0，然后加入1.64g NaAc 及5ml 0.5mol/L EDTA，用DEPC水定容至500ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，避光保存。

Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。

实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。

Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。

这里主要介绍目前常用的电转法。

电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。

一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。

常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。

实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。

2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。

3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。

4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。

5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。

杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。

2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。

3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。

4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。

5．0.1×SSC溶液。