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第三章-分子杂交与印迹技术

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分子印迹(渍)与分子杂交技术

分子印迹(渍)与分子杂交技术

• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
NL不具备) －－结合能力较NC膜低 －－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。 （1）物理吸印方法
原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要 因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重 要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋 白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一 种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需 要进一步完善和提高 用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以 是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则 杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～ 30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于 长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA 探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探 针。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE 配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
固相核酸分子杂交类型



Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置

核酸分子杂交

核酸分子杂交

RNA提取
RNA变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交
RNase 具有活性高，不 易灭活 抑制RNase活 性
所有的试剂和器皿都 必须进去除RNase 处理！！
变性处理：甲醛、乙二醛
破坏RNA二级结构
洗膜
放射自显影或化学显色
基本步骤
1. RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转 移至硝酸纤维素滤膜上。 2. 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱 于80℃干燥0.5-2小时。 3. 预杂交，时间为1-2小时。 4. 杂交 过夜 5. 洗膜 6. 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于70℃曝光24-48小时。

Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主 要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构， 保证RNA 完全按分子大小分离。

变性电泳主要有3 种:
甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳
羟甲基汞变性电泳

电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相 同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上, 然后与探针杂交。
3. 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物 质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐 减弱的原理，可以设置一定的屏障物来 进行防护。常用的材料有水、砖、大理 石、混凝土、重金属铅等。
32P
有机玻璃版 铅衣
4. 利用衰变：可利用放射性物质存在自发 衰变，其活性随之减少的原理进行外照 射防护。如：半衰期小于15天的放射性 废物，允许放置10个半衰期后作一般废 物处理。
注意事项 1. DNase I的量 2. dNTP a-P 3. 温度4-16℃
Pol I DNase I
两条链都可 被标记
随机引物合成法

分子核酸印迹技术及分子杂交

分子核酸印迹技术及分子杂交

个人自主学习研究报告本次研讨方向：70~80年代分子生物学与基因工程在技术上的突破本人承担的具体学习研讨主题：核酸印迹技术与分子杂交印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定固相支持物上的方法。

主要分类有两种：southern印迹，western印迹也称Western免疫印迹。

Southern印迹是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。

其过程是DNA分子被限制酶切，经琼脂糖凝胶电泳，将DNA片段按照分子量大小分离，然后将含DNA 片段的琼脂糖凝胶变性，将其中单链DNA转移到硝酸纤维滤膜或者其他固相支持物上。

而DNA片段的相对位置保持不变。

可用来下一步杂交反应；western印迹也称Western免疫印迹（Western Blot或Western Blotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。

能用碱变性，防止水解。

用甲醛变性。

分子杂交技术是用不同的DNA不同的DNA 片段之间，DNA 片段与RNA 片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。

像这样按照互补碱基配对原则而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。

分子杂交的方式有固相杂交、液相杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、southern印迹杂、northern印迹杂交、组织原位杂交核酸印迹技术和分子杂交自70年以来发展特别迅猛1971年，限制性核酸内切酶被发现，紧接着伯格在实验室中构筑了第一个重组的DNA分子，这意味着生物体的遗传性状可以人为地改造。

1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功,转化大肠杆菌,使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限。

分子杂交

分子杂交

(三) RNA探针
由于RNA是单链分子，所以它与靶序列 的杂交反应效率极高。早期采用的 RNA 探 针是细胞 mRNA 探针和病毒 RNA 探针，这 些 RNA 是在细胞基因转录或病毒复制过程 中得到标记的，标记效率往往不高，且受 到多种因素的制约（稳定性差，不易标 记）。这类 RNA 探针主要用于研究目的， 而不是用于检测。
由此可见成为核酸探针需具备以下基本条件： ①带有标记物而不影响其碱基配对特异性，便 于分析杂交体； ②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性； ③具有高度特异性，只与待测核酸杂交； ④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码 序列特异性低； ⑤灵敏度应高而稳定，标记方法简便而安全。
选
探针
选
标记物、法
选
分子杂交包括：核酸杂交及蛋白杂交等。 本章主讲核酸分子杂交。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
核酸分子杂交的理论基础：DNA变 性复性的现象（而复性是以碱基互 补序列为基础，只要两条单链之间 存在全部或部分碱基互补序列，就 可以相互结合形成双链）。
一、DNA变性
DNA的变性（Denaturation）是指在某些 理化因素作用下，DNA双链间氢键断裂、 双螺旋结构解开变成单链（不涉及核苷酸 间共价键的断裂），即DNA由稳定的双螺 旋结构变成无规则线团的现象。
变性（增色效应）
加热 退火
加热 退火
复性（减色效应）
三、核酸分子杂交
在 DNA 变性后的复性过程中，如果将不同种类 的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要 两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系， 在适宜的条件下就可以在不同的分子间形成杂化双 链（ DNA/DNA 、 DNA/RNA 、 RNA/RNA ），这 种现象称为核酸分子杂交(hybridization)。（复性发 生在不同来源的核酸单链之间，形成杂化双链的过 程）

分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用

分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用

（三）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
（四）DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定，也可直接测定。
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA
▪ 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响

分子杂交和印迹技术-文档资料

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（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
• 又称为Western杂交，或免疫印渍技 术，即利用抗原-抗体反应，检测转移 到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 • 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
FISH（fluorescence in situ hybridization）技 术是一种重要的非放射性原位杂交技术。 它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二 者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核 酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子 如生物素、地高辛，可利用该报告分子与 荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学 反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。
原位杂交 in situ hybridization
• 即组织原位杂交，指组织切片或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。 • 因此原位杂交可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置，这一点具有重 要生物学和病理学意义。
原位杂交(in situ hybridization)
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
• 又 称 为 Southern 杂 交 ， 即 DNA-DNA 杂交分析，是研究 DNA 图谱的基本技 术，主要用于基因组 DNA 的分析，如 在基因组中特异基因的定位及检测等， 在遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物 分析等方面有重要价值。

分子印迹与杂交技术

第 21 章
分子生物学常用技术
第一节 分子印迹与杂交技术
Molecular hybridization & blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间 形成杂化双链的这种现象。
2. 印迹(blotting)定义 将存在于凝胶中的生物大分子转移（印 迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分 析的技术。
3. 应用 广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展 电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
指经过特殊标记的核酸片段，它具
有定的序列，能够与待测的核酸片段
Kary B. Mullis
La Jolla, CA, USA
1944 -
Michael Smith
University of British Columbia Vancouver, Canada
1932 - 2000
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
n 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法 检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
用已知的特异 抗体检测目的 基因蛋白
SDS-PAGE purified recombinant human CK2α subunit and its Western blotting

分子杂交和印迹技术

2018年12月18日4时6分 18
(3) DNA的末端标记 1) DNA的3′末端标记
5′ 3′ 限制性内切酶 3′ 3′ 5′
DNA 聚合酶ⅠKlenow 片 段 ： 保 留 5 ’→ 3 ’ DNA 聚 合 酶 活 性 , 弱 3’→5’ 外切酶活性， 无 5’→3’ 外切酶活性。
2018年12月18日4时6分 17
优点：
Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定， 可以获得大量的有效探针；
对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模 板也可进行反应； 产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针； 随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。
术就可以显现杂交分子的有无和位置。
2018年12月18日4时6分 5
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作
（4）基因突变分析
（5）疾病的诊断
2018年12月18日4时6分 6
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念：
用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列 的DNA或RNA的互补标记片段： 与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。
2018年12月18日4时6分 14
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链 DNA 上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5 ’→ 3 ’ DNA 聚合酶活性； 5 ’→ 3 ’ 外 切 核 酸 酶活性。
2018年12月18日4时6分 15
2018年12月18日4时6分 3
一、印迹技术(blotting)
指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定 化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。

《现代医学实验仪器与实验技术》分子杂交印迹技术



10% AP： 0.15ml

TEMED：
6μl

2. 浓缩胶的配制(4ml) ( 4% 浓缩胶)

ddH2O：
2.8ml

30% 储备胶： 0.66ml

1.0M Tris-HCl ： 0.5ml (pH 6.8)

10% SDS： 0.04ml

10% AP：
0.04ml

TEMED：
4μl
免疫印迹（Western Blot）的基本步骤
1. 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更 加方便；
2. 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20200μ g/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μ g/ml。
特点
3. 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试 剂用量；
4. 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响；
Bradford法实验原理
1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法（Bradford法）， 它的原理是考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm， 溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要 是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨 基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋 白质浓度成正比。
Western 免疫印迹
限制性内切酶酶切DNA溶液
电 泳
RNA样品
转 移
转移到NC膜后与
杂
标记的探针杂交
交
转移到NC膜or尼 龙膜后与标记的 探针杂交
蛋白质样品
转移到NC膜or PVDF膜后与标记 的探针杂交

(发酵分析)分子杂交

主要步骤：
– 蛋白质样品的制备 – SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 – 蛋白质的电转移：NC膜 – 靶蛋白的免疫学检测
• 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标，二抗）反应 • 显色反应：酶促反应
转移与印迹
膜固定蛋白 第一抗体
双抗体检测
第二抗体
显色底物
有色（发光） 产物
酶/ 荧光染料
卵白素或 链亲和素
生物素
颜色反应或 发光反应
地高辛标记检测：利用抗地高辛抗体可专一性结合， 地高辛的特性，其余方法同生物素检测。
（二）Southern Blotting
1 原理和步骤 将待检测的DNA分子用/不用限制性
内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而 将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄 膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记 的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探 针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合， 游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测， 从而显示出待检的片段及其相对大小。
酶促反应转移与印迹双抗体检测膜固定蛋白第一抗体第二抗体显色底物有色发光产物southernnorthernwestern一分子杂交简介二核酸分子杂交技术三蛋白杂交技术四生物芯片技术采用光导原位合成或微量点样等方法将大量生物大分子有序地固化于支持物的表面组成密集二维分子排列然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析从而判断样品中靶分子的数量
逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成 氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复 性。
3 核酸分子杂交 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下， 按碱基配对原则形成双链的过程。
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的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
.
四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝
数及表达丰度。
.
第二节 核酸分子杂交的方法
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
为
1 2
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
二、分子杂交
• 将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核 酸分子放入同一个反应体系，两条互补链 可通过复性重新缔合形成双链，这一过程 成为核酸分子杂交。
.
三、探针
探针：是指带有标记物的、能与被检测
的核酸片段互补的一段已知核酸片段。
.
酶促标记法 1.切口平移法（nick translation)
1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
.
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
.
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
.
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
.
五、原位杂交
1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中 的核酸进行杂交，称原位杂交。
根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂 交；
根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、 RNA/RNA 杂交；
根据杂交物分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交。
.
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
（一）探针的种类
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
.
（二） 探针的制备方法
制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
.
合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（50-300 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列
.
（七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析
.
二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA
.
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
.
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo
.
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
.
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
.
.
三、影响杂交的因素
1、探针分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
.
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
.
.
（五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
.
（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
融解温度： 定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时 的温度。
.
（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复 性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
• 固-液相杂交
印迹杂交
原位杂交
•液相杂交
按照杂交分子特性分
•DNA-DNA杂交
•DNA-RNA杂交
•蛋白质杂交
.
一、Southern印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。
.
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
片上脱落
.
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
.
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
相同，最好不用。
.
（三）标记物 1.想标记物应具备的特性： • 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
.
2. 标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
.
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序
的总长度 （2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对
杂交率取决于DNA的相对复杂性
.
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针
.
Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern
印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
.
三、 Western印迹杂交
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（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
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（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程
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1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
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2.随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合， 作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。
另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互 补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷 酸掺入到新合成的DNA分子中
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第三章 分子杂交与印迹技术
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第一节 核酸分子杂交的基本原理
一、变性与复性
（一）变性 1、定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键
断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成 为单链。
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2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
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（四）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代
谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合 成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
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体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
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