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5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
预混型BCIP/NBT溶液Premixed BCIP/NBT Solution华越洋----------------------------------------------介绍：华越洋预混型BCIP/NBT溶液是在BCIP/NBT底物显色试剂盒的基础改良而得的。
特点：含有BCIP和NBT两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。
在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物（包括分开提供的BCIP/NBT溶液）一样的灵敏度。
稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。
可用于Western Blot。
运输及保存常温运输和保存（避光），有效期一年。
自备试剂Western印迹膜洗膜液或TBST缓冲液。
使用方法按常规方法进行Western印迹膜杂交，直到跟二抗-AP复合物保温这步结束。
用Western印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。
注意：可以用TBST缓冲液代替Western印迹膜洗膜液。
用水迅速冲洗一次。
将印迹膜转移到本产品中（每cm2印迹膜需要0.1mL 本产品），室温平缓摇晃5-30分钟显色。
37℃可加速反应。
细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后（一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关）迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。
数分钟后需要换水，共三次。
用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。
BCIP/NBT反应原理BCIPNBTBCIP被碱性磷酸酶水解后形成一个中间体。
这个中间体被异构化以后的产物与NBT 反应生成白色的中间体二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。
深圳依诺金生物科技有限公司 - 1 - 产品说明书地高辛杂交检测试剂盒 I目录号: DIGD-110装量: 10次显色检测反应保存期: 12个月.存储条件:NBT/BCIP显色底物–20℃抗DIG-AP酶结合物4℃其它组分室温试剂盒组成:阻断液母液(10x) 50 ml抗DIG-AP 酶结合物20 µl NBT/BCIP显色底物 2 ml检测缓冲液(5×) 50 ml顺丁烯二酸缓冲液母液(2x) 500 ml Tween-20 3 ml 10% SDS 20 ml 20×SSC 100 ml使用前先用DEPC/无RNase水将5×检测缓冲液及2×顺丁烯二酸缓冲液母液稀释成1×工作液.一.预杂交:1. 将膜从包装袋中取出，用干净的剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去。
放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口。
2. 加入65℃预热的Hyb高效杂交液5mL，排尽气泡，封口。
放65℃水浴振荡杂交1～2小时。
3. 如果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5-10ml)。
如果膜的大小适中，也可以用无菌的50ml离心管(BD公司)进行，5ml杂交液已足够。
将杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟预杂交1～2小时。
二.杂交:1. 探针的处理：将标记好的探针放100℃煮10分钟，立即放冰浴冷却10分钟。
2. 将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5mLHyb高效杂交液，加入变性的探针(1-3µl/膜，5－20ng/mL Hyb杂交液)，混匀。
加入到杂交袋中，小心排尽气泡，封口，65℃水浴振荡杂交过夜。
3. 如果使用杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的Hyb高效杂交液(5-10ml)，加入变性过的探针(1-3µl/膜，或5－20ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。
加入到杂交管中，杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟，杂交过夜。
Instruction manual (说明书)：AllergyScreen过敏原检测试剂盒1.用途AllergyScreen过敏原定量检测系统采用免疫印迹方法，定量检测人血清中过敏原特异性IgE抗体。
2.概述IgE免疫球蛋白发现始于1964年，它在I型变态反应发生机制中起重要作用。
免疫应答时B淋巴细胞分化成熟为浆细胞，并合成和分泌不同类型的抗体。
该过程由Th和Ts细胞调节，如果调节失控，通常不会造成损害的抗原也能激发免疫应答，刺激抗原特异性B细胞分化成熟为浆细胞，并产生IgE抗体, IgE抗体通过Fc段同嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面Fc受体结合。
当同一变应原再次进入机体，直接作用于IgE，并通过它的决定簇与IgE分子Fab段间的结合，形成IgE 受体聚集成片,这些变化最终导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺等生物活性物质，从而产生如麻疹`荨麻疹、皮炎、关节炎，枯草热（过敏性鼻炎）`哮喘及过敏性休克等典型的I型变态反应症状。
3.检测原理特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面，置于反应槽中。
用移液器加入病人血清，室温下孵育，标本中过敏原特异性的IgE抗体与过敏原发生反应，并连接在硝酸纤维素膜上。
将多余的抗体冲洗脱掉，再加入标记了生物素的抗人IgE 抗体，室温下孵育，冲脱未结合上的抗抗体。
然后加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温下孵育，链霉亲和素和生物素结合。
将未结合上的酶标链霉亲和素冲洗干净。
当再加入BCIP/NBT酶作用底物并孵育后，碱性磷酸酶发生特定的酶显色反应，试剂条上出现沉淀。
颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。
待试剂条干燥后，CCD相机照相，读取检测结果。
4.检测系统组成每套检测系统包括：1×12 检测条：标记有20种过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中（混合过敏原组，吸入组，食物组）1×洗脱液：（TRIS/NaCl，包含0.1%NaN3）可稀释成1x500ml 的清洗液，pH=7.5 （20ml）1×标记有生物素的抗人IgE抗体（白盖，多抗），含 0.1%NaN3 1×酶标链霉亲和素（红盖），连接有碱性磷酸酶的链霉亲和素1×底物（蓝盖），BCIP/NBT12×加样吸管（300微升）1×使用说明书5.未提供的实验所需的其他工具5.1稀释液蒸馏水或去离子水5.2 其他搅拌器；量筒（500毫升），500毫升洗瓶，具10个不同板型的洗板机（也可无），避光的孵育箱（具体要求见MEDIWISS说明书）；水平混匀器；电吹风（也可无）；专用阅读仪（RAPID READER）和电脑（Windows98，Windows2000 ME或Windows2000 PROF 带USB接口）及打印机。
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
仅供科研使用版本号：180718BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒【产品组成】【保存条件】4℃,避光,12个月。
【产品概述】BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。
BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。
【使用方法】1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。
2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。
3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液：4、洗涤完毕后，去除洗涤液。
5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。
5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。
7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red stainingsolution)染色，以便于观察。
对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
【注意事项】1、BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。
PH0405|BCIP/NBT即用型显色试剂盒Ready-to-use BCIP/NBT Solution,PremixedCatalog No：PH0405Size：☐100mL Store at2~8℃简介BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐＋NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶（AP）最佳的底物组合之一。
在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化合物。
该试剂盒可用于AP系统的IHC和Western Blot实验的酶促显色。
在AP催化下，在组织切片或印迹膜上结合了AP偶联物的地方产生深蓝色沉淀，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。
本染色液为即用型工作液，可以直接使用，不用稀释。
使用参考1.印迹膜显色：将本品滴加在待检测的印迹膜上（或将印迹膜浸入到BCIP/NBT显色液中），室温避光孵育10-20分钟。
显色完毕后，将膜浸入水中，终止反应。
注：印迹膜显色前要用1×TBST漂洗3次，每次10分钟。
不要用1×PBST漂洗，因为无机磷是AP的强烈抑制剂。
2.组织切片或细胞爬片显色：滴加适量的BCIP/NBT显色液于需要显色的组织切片或细胞爬片上，室温避光孵育10-20分钟。
显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。
显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。
注意事项1）BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。
样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。
AllergyScreen过敏原诊断试剂盒标准操作规程（SOP）1．原理标本中过敏原特异性IgE抗体与吸附在硝酸纤维素膜上的过敏原发生抗原抗体特异性反应，形成抗原抗体复合物，标记了生物素的抗人IgE抗体与抗原抗体复合物反应，结合有碱性磷酸酶的链霉亲和素，生物素结合。
碱性磷酸酶与底物BCIP/NBT发生特定的酶显色反应。
颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。
2．标本采集与处理2.1 受检者的准备：病人最好空腹采集血样。
注意有无应用影响IgE水平的药物，如激素、免疫调节药等。
2.2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。
在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
2.3 抗凝剂：血浆使用枸橼酸盐作为抗凝剂，不能使用肝素或EDTA抗凝剂。
2.4 标本处理：本系统推荐用人血清为标本，亦可用血浆为标本。
静脉采血待血清自然析出或离心（4000G/转）10分钟，在两小时内检测完毕；如两小时内不能检测完毕，将离心分离血清或血浆置洁净试管加盖2-8℃下保存一周。
若需保存更长时间，应置于-20℃以下储藏。
3．试剂3.1 试剂本实验使用的是德国MEDIWISS公司提供的AllergyScreen过敏原诊断试剂盒，试剂组分如下：检测条标记有过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中洗脱液 20ml， TRIS/NaCl，可稀释成500ml 的清洗液，pH=7.5抗人IgE抗体 4ml，标记有生物素的，含 0.1%NaN3链霉亲和素 4ml，连接有碱性磷酸酶BCIP/NBT 4ml3.2 试剂的稳定性原包装试剂储存在2-8℃至标签所示失效日期。
稀释过的清洗液在2-8℃下至多保存八周。
4．仪器过敏原检测仪（Mediwiss，Moers，Germany）可以检测到0.25%或更高的光密度信号。
当光密度是5%是可达到0.2%光密度的重复性。
地高辛标记与检测D N A试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。
此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1 无标记对照DNA12 无标记对照DNA23 DNA稀释缓冲液2管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4 DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率5 六聚核苷酸混合物6 标记用混合物7 DNA聚合酶1大片段标记级8 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物200μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9 NBT/BCIP10 封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
在每个操作程序的前面提供了详细的信息。
操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒I说明书版本：Version11 （2010年8月）利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。
本试剂盒可对10ng-3μg DNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）。
产品目录号：11 745 832 910试剂盒于-15 ~ -25℃保存1. 概况1.1 说明书内容1. 概况 (2)1.1说明书内容 (2)1.2试剂盒组成 (3)2. 介绍 (4)2.1 产品概述 (4)3. 实验步骤和需要的材料 (7)3.1 实验开始前准备 (7)3.2 DIG-DNA标记 (7)3.3定量标记反应效率 (10)3.4 DNA转膜和固定 (12)3.5杂交 (13)3.6 免疫检测 (14)3.7探针洗脱和重探 (16)4. 结果 (17)4.1 典型结果 (17)5 附录 (18)5.1 疑难问题解决 (18)5.2参考文献 (18)1.2 试剂盒组成杂交反应所需的仪器和其他反应试剂请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表：带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。
2. 介绍2.1 产品概述反应原理DIG High Prime DNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA 标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。
应用DIG标记的DNA探针可用于：•所有形式的膜杂交反应•（微生物，人类，植物等）基因组DNA中的单拷贝基因检测样本•大小在100bp以上的DNA片段•线性化质粒，粘粒或λDNA•超螺旋DNA分析时间试剂盒反应次数本试剂盒包含•对10ng-3μg DNA进行12次标记反应• 24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）质量控制对DNA对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将0.1pg同源DNA点膜后进行斑点杂交，显色16h呈阳性检测结果（1pg同源DNA的杂交反应显色1h后呈阳性检测结果）。
Western blot的原理、操作及注意事项三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。
有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。
因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1 实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
2 实验操作（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。
再转入transfer buffer中。
D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
（2）转移A.在电转移仪上铺好下层滤纸。
一般用三层。
B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。
C.将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。
倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。
F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
3 注意事项及常遇到的问题1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明
货号：PR1100
规格：25ml/125ml
保存：-20℃避光保存，复检期至少半年。
产品内容：
25ml125ml
25×BCIP1ml5ml
25×NBT1ml5ml
1×AP反应缓冲液30ml75ml×2
产品简介：
NBT即氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。
BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate),在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。
使用说明：
1.取40ul25×NBT加入到1ml1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。
注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。
2.把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。
3.当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。
注意事项：
BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
相关试剂：
A1800抗体稀释液（普通型）
A1830AP标记抗体稀释液
SA0012SABC(小鼠IgG)-AP kit。
