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采用直接注射法制作BALB／c小鼠肝癌原位移植瘤模型探讨摘要目的：培养小鼠BNL肝癌细胞，采用直接注射法制作BALB/c小鼠肝癌原位移植瘤，为后续实验奠定基础。
方法：小鼠BNL肝癌细胞体外培养，将调整好的对数生长期的肝癌细胞直接注射到小鼠肝脏，15日后解剖实验小鼠取下肝左叶，4%多聚甲醛固定、常规组织包埋、切片及HE染色后镜下观察。
结果：实验小鼠在肝脏左叶均可以见到肿瘤生长，HE染色示肝细胞肝癌。
结论：直接注射法制作BALB/c小鼠肝癌原位移植瘤模型可操作性强，成癌率高且周期短，值得推广使用。
标签：BALB/c小鼠；肝癌；原位移植瘤；前言肝癌是世界范围内发病率第五，死亡率第三的癌症，而在我国肝癌死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位[1 2]。
所以早期发现、早期诊断、早期治疗是肝癌防治的关键。
因此，如果能够建立一个类似人肝癌的理想模型，从而积极的用于癌症的相关研究，将会对肝癌药物的临床实验治疗具有深远的意义。
建立肝癌的模型临床报道较多，但采用培养好的肝癌细胞直接注射在小鼠肝脏上制作肝癌原位模型在临床上是比较常见的[3]。
查阅文献发现BALB/c小鼠属于近交系的小鼠，此类小鼠的成瘤率高，而且容易饲养，因此我们探索了采用直接注射法[4]建立BALB/c小鼠肝癌原位移植瘤的方法。
1 实验材料与方法1.1 实验动物健康雌性BALB/c近交系小鼠，6周龄，体重18±2g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK（京）2009-0007，饲养于贵阳中医学院中心实验室动物房。
1.2 实验试剂胎牛血清、DMEM高糖购自美国Gibco公司，青链霉素混合液、0.25%的胰蛋白酶购自美国Hyclone公司。
1.3 实验方法和步骤1.3.1 细胞培养将购买的小鼠BNL肝癌细胞株培养于浓度为15%的DMEM 高糖培养基中，37度，5%的CO2培养箱中常规培养，细胞生长到一定程度用0.25%的胰蛋白酶进行消化，继续传代培养，最终达到实验要求的细胞浓度。
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.03.016淫羊藿苷抑制β⁃catenin 和NF⁃κB p65的活性对小鼠胰腺癌皮下移植瘤生长和运动的调节①代云龙 吴礼国② 章志军 欧 扬 黄俊伟 彭 兵③ (温江区人民医院肝胆外科,温江611130) 中图分类号 R735.9 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)03⁃0343⁃06①本文为四川省卫生和计划生育委员会2015年科研课题(No.150033)㊂②温江区人民医院消化内科,温江611130㊂③四川大学华西医院肝胆外科,成都610000㊂作者简介:代云龙,男,主治医师,主要从事肝胆外科相关工作,E⁃mail:vp0uf5x9gyt42@㊂[摘 要] 目的:研究淫羊藿苷调控小鼠胰腺癌皮下移植瘤生长和运动的机制㊂方法:建立BALB /c 小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型后,分别给予生理盐水(对照组)㊁10mg /kg 淫羊藿苷(低剂量组)㊁20mg /kg 淫羊藿苷(中剂量组)㊁40mg /kg 淫羊藿苷(高剂量组)㊁5mg /kg 阿霉素(阿霉素组)腹腔给药干预,干预25d 后取出瘤体,检测瘤体重量和体积,并根据小鼠存活情况绘制生存曲线;TUNEL 染色观察瘤组织凋亡情况,免疫组化检测Ki67㊁血管内皮生长因子(VEGF)蛋白阳性表达率;qRT⁃PCR 检测瘤组织中生长和运动标记分子基因相对表达情况,Western blot 检测Wnt /β⁃catenin 和核因子κB(NF⁃κB)p65信号通路关键蛋白表达情况㊂结果:与对照组相比,中㊁高剂量淫羊藿苷及阿霉素干预后,移植瘤的重量㊁体积,瘤组织中Ki67㊁VEGF 的阳性表达率,Ki67㊁VEGF㊁基质金属蛋白酶⁃9(MMP⁃9)的mRNA 相对表达量,β⁃catenin 蛋白表达量㊁NF⁃κB p65蛋白磷酸化水平均显著降低(P <0.05),小鼠的25d 存活率㊁瘤组织细胞凋亡率以及Caspase⁃3的mRNA 相对表达量均显著升高(P <0.05)㊂结论:淫羊藿苷可能通过抑制β⁃catenin 和NF⁃κB p65的活性下调增殖及运动相关基因表达,上调凋亡相关基因表达从而调节小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生长和运动㊂[关键词] 胰腺癌;淫羊藿苷;Wnt /β⁃catenin;核因子κBRegulation of icariin on growth and movement of subcutaneous xenografts in pancreatic cancer mice by inhibiting activity of β⁃catenin and NF⁃κB p65DAI Yun⁃Long ,WU Li⁃Guo ,ZHANG Zhi⁃Jun ,OU Yang ,HUANG Jun⁃Wei ,PENG Bing .Department of Hepatobiliary Surgery ,Wenjiang District People′s Hospital ,Wenjiang 611130,China[Abstract ] Objective :To study mechanism of icariin on regulating growth and movement of subcutaneous xenografts inpancreatic cancer mice.Methods :After establishing subcutaneous xenografts models of pancreatic cancer BALB /c mice,they were in⁃traperitoneally administered with normal saline(control group),10mg /kg icariin (low dose group),20mg /kg icariin (middle dose group),40mg /kg icariin(high dose group),and 5mg /kg doxorubicin(doxorubicin group).At 25d after intervention,tumors were taken out.The tumor weight and volume were measured.The survival curves were drawn by survival conditions of mice.The apoptosis of tumortissue was observed by TUNEL staining.The positive expression rates of Ki67and vascular endothelial growth factor(VEGF)protein were detected by immunohistochemistry.The relative expression of growth and movement marker molecules genes in tumor tissue was detected by qRT⁃PCR.The expression of key proteins in Wnt /β⁃catenin and nuclear factor⁃κB(NF⁃κB)p65signaling pathway was detected by Western blot.Results :Compared with control group,after intervention with middle and high dose of icariin and doxorubicin,weight and volume of xenografts,positive expression rates of Ki67and VEGF in tumor tissue,relative expression quantities of Ki67,VEGF and matrix metalloproteinase⁃9(MMP⁃9)mRNA,expression quantity of β⁃catenin protein and phosphorylation level of NF⁃κB p65protein were significantly decreased(P <0.05),while 25⁃d survival rate,apoptosis rate of tumor tissue and relative expression quantity of Caspase⁃3mRNA were significantly increased (P <0.05).Conclusion :Icariin may down⁃regulate expression of proliferation and movement related genes,and up⁃regulate expression of apoptosis related genes by inhibiting activity of β⁃catenin and NF⁃κB p65,thusregulating growth and movement of subcutaneous xenografts in pancreatic cancer mice.[Key words ] Pancreatic cancer;Icariin;Wnt /β⁃catenin;Nuclear factor κB 胰腺癌是消化道类肿瘤中恶性程度极高的一种,其解剖位置的特殊性导致大部分胰腺癌患者确诊时已为晚期,手术切除率低,对抗癌药物的敏感性也低,因此其预后极差,病死率在所有肿瘤中居第4位[1,2]㊂Wnt /β⁃catenin 信号通路在胚胎发育过程中发挥着重要的作用,异常高表达会诱导肿瘤发生,目前研究表明,在胰腺癌肿瘤细胞中Wnt/β⁃catenin信号通路激活后,能够促进其增殖㊁侵袭㊁转移并抑制细胞凋亡[3,4]㊂核因子κB(nuclear factor kappa B, NF⁃κB)通常以同源或异源二聚体形式存在于细胞的胞质中,p65作为其活性部分,可通过调控细胞凋亡等基因表达水平来参与到肿瘤的发生㊁发展进程中[5]㊂淫羊藿苷是从传统中药淫羊藿中分离出来的黄酮类化合物,具有广泛的生物学效应,包括抗炎,抗抑郁,改善男性性功能,保护心血管,增强骨愈合和神经保护作用[6],此外,淫羊藿苷已被证明在各种人类癌细胞中发挥体外抗增殖作用,例如结肠癌㊁乳腺癌㊁胃癌等[7⁃9],但淫羊藿苷体内抗癌活性的相关研究较少㊂本研究旨在通过建立裸鼠移植瘤模型,并给予不同剂量淫羊藿苷及阿霉素腹腔注射,检测瘤体中癌细胞生长㊁运动及Wnt/β⁃catenin㊁NF⁃κB信号通路关键蛋白的表达情况,为胰腺癌的治疗提供新思路㊂1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物来源 清洁级雌性BALB/c小鼠125只,4~5周龄,平均体重(16.37±1.07)g,购自北京阜康生物科技股份有限公司[生产许可证号: SCXK(京)2014⁃0009],所有BALB/c裸鼠均饲养在中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房[SYXK(京)2015⁃0035]㊂1.1.2 主要试剂及仪器 人胰腺癌SW1990细胞株(上海细胞研究所,本实验室自行传代培养);淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所,纯度99.9%);阿霉素(美国Sigma公司);胎牛血清(FBS)㊁RPMI⁃1640培养基(Gibco公司);Ki67㊁VEGF㊁Caspase⁃3㊁MMP⁃9引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成);总RNA提取试剂盒㊁反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(赛默飞世尔科技公司);全蛋白提取㊁BCA蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物有限公司);兔抗小鼠Ki67㊁VEGF㊁β⁃catenin㊁p65㊁p⁃p65㊁GAPDH多克隆抗体(美国Abcam公司);TDL⁃4台式离心机(上海安亭科学仪器厂);IX51倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);Image Master VDS凝胶自动成像仪(瑞典Pharmacia公司)㊂1.2 方法1.2.1 细胞培养 人胰腺癌SW1990细胞株在含10%胎牛血清㊁100U/ml青霉素或链霉素的RPMI1640培养液培养,在37℃㊁5%CO2培养箱中培养至对数期,用生理盐水进行漂洗后,0.25%胰蛋白酶消化液处理2min后弃除胰蛋白酶,再加入完全培养基洗脱细胞,制成细胞悬液㊂1.2.2 移植瘤模型制备及处理 将1.2.1中制备好的细胞悬液浓度调整为1×108ml-1后注射于裸鼠右腋下,肿瘤直径大于5mm时则成为移植瘤标准,将制备成功的裸鼠随机等分为对照组㊁低㊁中㊁高剂量淫羊藿苷组㊁阿霉素组,每组25只,其中对照组在肿瘤周围皮下注射盐水,低㊁中㊁高剂量淫羊藿苷组于腹腔注射10㊁20㊁40mg/kg的淫羊藿苷溶液,1周连续注射5次,连续3周,阿霉素组于腹腔注射5mg/kg的阿霉素溶液,每周第1天和第4天注射,连续3周,注射后继续培养3d后处死裸鼠,分离肿瘤并测定肿瘤质量及体积,并将一部分肿瘤组织置于4%甲醛溶液中固定,用于癌细胞凋亡观察以及免疫组化观察,另一部分肿瘤组织置于-80℃存储,用于qRT⁃PCR与Western blot检测㊂各组裸鼠试验期间均在培育室饲养,温度20~25℃,湿度保持在50%~55%,进行人工光照(12h/昼㊁12h/夜),裸鼠全天自由饮水与饮食㊂1.2.3 肿瘤大小㊁体积及小鼠存活率检测 将1.2.2中分离得到的肿瘤组织用游标卡尺测量其长径(a)和短径(b),并根据公式:肿瘤体积(V)=a×b2/2计算肿瘤体积;记录各组小鼠存活情况㊂1.2.4 TUNEL染色观测瘤组织癌细胞凋亡情况 取1.2.2中各组裸鼠移植瘤组织进行常规石蜡包埋,根据免疫组织化学试剂盒中说明书进行操作,并在显微镜下观察并采集图像㊂随机选取5个视野,记录200个细胞中阳性细胞数,细胞凋亡情况运用末端标记技术TUNEL法检测且采用TUNEL指数表示㊂细胞核呈现为棕黄色者视为凋亡细胞㊂1.2.5 免疫组化观察瘤组织中Ki67㊁VEGF蛋白阳性表达率 取1.2.2中各组裸鼠移植瘤组织进行常规石蜡包埋切片后,脱水㊁PBS溶液漂洗㊁3%H2O2与甲醇混合液浸泡10min,超纯水漂洗㊁抗原修复㊁PBS漂洗5min㊁加入一抗37℃反应2h㊁PBS漂洗5min㊁加入二抗37℃反应40min㊁PBS漂洗5min㊁DAB室温显色20~30min,镜检观察有棕黄色颗粒出现时则采用自来水终止㊂再用苏木素复染30s㊁自来水漂洗㊁中性树胶封片,光镜下观察细胞样本中Ki67㊁VEGF的阳性表达细胞,其细胞浆表现为棕黄色颗粒㊂每张片子400×视野10个,统计阳性细胞数目,以计算阳性细胞率,阳性细胞率(%)=阳性细胞数目/总细胞计数×100%㊂1.2.6 qRT⁃PCR检测瘤组织中Ki67㊁VEGF㊁Caspase⁃3㊁MMP⁃9相对表达水平 按照总RNA提取试剂盒说明书上操作步骤提取各组小鼠瘤组织中的总RNA,提取后用紫外分光光度计检验,OD值(A260/A280)=1.8~2.0,并用凝胶电泳检测RNA 的完整性㊂按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成㊂反转录体系(10μl):2×miRNA反应混合液5μl,0.1%BSA1μl,miRNA PrimeScript⁃RT酶混合物1μl,总RNA0.5μl,去RNA酶ddH2O2.5μl㊂反应条件设置:37℃60min,85℃5s,4℃30min㊂PCR体系10μl:SYBR⁃Prmix Ex Tap II(2×)5μl,上游引物0.4μl,下游引物0.4μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.2μl,cDNA1μl,ddH2O3μl㊂详细操作见试剂盒说明书㊂PCR反应参数设置:50℃激活聚合酶5min,95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火和延伸34s,反应进行40个循环㊂溶解曲线绘制:95℃15s,60℃60s,85℃15s,60℃15s㊂每个样孔设置3个复孔㊂用2-ΔΔCt法计算mRNA的表达量㊂1.2.7 Western blot检测瘤组织中β⁃catenin㊁p65㊁p⁃p65表达水平 将1.2.2中提取的瘤组织用BCA 法提取总蛋白后,利用Bradford调整各组蛋白浓度一致,经SDS⁃PAGE凝胶电泳㊁电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜,密封2h,加入兔抗鼠β⁃catenin㊁p65㊁p⁃p65㊁GAPDH(1∶1000)一抗4℃孵育过夜,TBST 漂洗40min,加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1h,TBST漂洗40min,ECL发光液将PVD膜显色,暗室曝光到X线片上,采用Imaging System软件分析各组条带灰度值,以目标蛋白与内参积分吸光度值比值表示蛋白的相对表达水平㊂1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行数据分析㊂对于服从正态分布的连续型实验数据结果用均x±s表示,采用单因素方差分析(one⁃way ANOVA)进行多组间比较,组间差异有统计学意义时,进一步采用SNK方法进行两两比较㊂利用Kaplan⁃Meier 法分析小鼠生存率,Log⁃rank法进行检验㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 淫羊藿苷对小鼠移植瘤重量㊁体积及存活率的影响 与对照组相比,中㊁高剂量淫羊藿苷及阿霉素干预后,瘤体重量及体积均显著降低见图1㊁表1, 25d存活率显著升高见图2㊁表1,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂2.2 淫羊藿苷对瘤体癌细胞凋亡的影响 TUNEL 结果显示:与对照组相比,中㊁高剂量淫羊藿苷及阿霉素处理后癌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)㊂见图3㊁表2㊂2.3 淫羊藿苷对瘤组织中Ki67㊁VEGF蛋白阳性表达率的影响 免疫组化结果显示:与对照组相比,中㊁高剂量淫羊藿苷及阿霉素处理后癌组织中Ki67㊁VEGF蛋白的阳性表达率显著降低(P< 0.05)㊂见图4㊁表3㊂2.4 淫羊藿苷对瘤组织中Ki67㊁VEGF㊁Caspase⁃3㊁图1 各组裸鼠瘤体情况比较Fig.1 Comparison of tumor conditions of nude mice in each group表1 各组裸鼠移植瘤重量㊁体积及存活率比较(x±s,n=5) Tab.1 Comparison of cancer cell weight,volume and survival rate of tumor in nude mice among allgroups(x±s,n=5)Groups Weight(g)Volume(mm3)Survival rate(%) Control group0.49±0.051864.03±294.3252.00 10mg/kg icariin group0.45±0.061798.18±209.1844.00 20mg/kg icariin group0.26±0.031)932.63±164.521)80.001) 40mg/kg icariin group0.15±0.041)423.59±127.411)92.001) Adriamycin group0.14±0.031)349.78±96.791)96.001) Note:Compared with control group,1)P<0.05.图2 各组裸鼠25d存活率比较Fig.2 Comparison of25d survival rate of nude mice among all groupsMMP⁃9相对表达水平的影响 qRT⁃PCR 结果显示:与对照组相比,中㊁高剂量淫羊藿苷及阿霉素处理后癌组织中Ki67㊁VEGF㊁MMP⁃9相对表达水平显著降低(P <0.05),Caspase⁃3相对表达水平显著升高(P <0.05)㊂见表4㊂图3 各组裸鼠瘤组织的TUNEL 染色结果(×400)Fig.3 TUNEL staining results of tumor tissues of nudemice in each group (×400)表2 各组裸鼠瘤组织癌细胞凋亡率比较(x ±s ,n =10)Tab.2 Comparison of cancer cell apoptosis rates of tumortissues in nude mice among all groups (x ±s ,n =10)GroupsApoptotic rate(%)Control group 5.12±1.5310mg /kg icariin group 5.24±1.2720mg /kg icariin group 28.35±4.811)40mg /kg icariin group46.57±6.211)Adriamycin group48.25±7.421)Note:Compared with control group,1)P <0.05.图4 各组裸鼠瘤组织的免疫组化结果(×400)Fig.4 Immunohistochemical results of nude mice tumortissues in each group (×400)表3 各组裸鼠瘤组织中Ki67㊁VEGF 蛋白阳性表达率情况(x ±s ,n =10)Tab.3 Comparison of Ki67positive expression rate andVEGF positive expression rate of tumor tissues in nude mice among all groups (x ±s ,n =10)GroupsKi67positiveexpression rate(%)VEGF positiveexpression rate(%)Control group30.48±8.5361.25±18.5310mg /kg icariin group 25.24±1.2758.21±16.2720mg /kg icariin group 8.55±2.621)37.65±12.511)40mg /kg icariin group 3.52±1.171)22.34±10.171)Adriamycin group 2.12±0.481)20.08±8.251)Note:Compared with control group,1)P <0.05.表4 各组裸鼠瘤组织中Ki67㊁VEGF ㊁Caspase⁃3㊁MMP⁃9相对表达水平情况(x ±s ,n =10)Tab.4 Relative expression levels of Ki67,VEGF ,Caspase⁃3and MMP⁃9in nude mice tumor tissues of each group (x ±s ,n =10)GroupsKi67mRNA(2-ΔΔCt )VEGF mRNA(2-ΔΔCt )Caspase⁃3mRNA(2-ΔΔCt )MMP⁃9mRNA(2-ΔΔCt )Control group 1.00±0.021.00±0.031.00±0.011.00±0.0110mg /kg icariin group 0.93±0.070.82±0.081)1.06±0.080.85±0.0920mg /kg icariin group 0.61±0.031)0.44±0.061)1.92±0.351)0.47±0.071)40mg /kg icariin group 0.25±0.041)0.13±0.021)4.25±0.941)0.15±0.041)Adriamycin group0.31±0.051)0.11±0.021)4.01±0.891)0.16±0.031)Note:Compared with control group,1)P <0.05.图5 各组裸鼠瘤组织中β⁃catenin ㊁p65㊁p⁃p65蛋白表达图谱Fig.5 Expression maps of β⁃catenin ,p65and p⁃p65protein in nude mice tumor tissues of each groupNote:1.Control group;2.10mg /kg icariin group;3.20mg /kg icariingroup;4.40mg /kg icariin group;5.Adriamycin group.表5 各组裸鼠瘤组织中β⁃catenin ㊁p65㊁p⁃p65蛋白表达情况比较(x ±s ,n =10)Tab.5 Comparison on expression of β⁃catenin ,p65and p⁃p65protein in nude micetumor tissues among all groups (x ±s ,n =10)GroupsProtein expression(IA Target protein :IA GAPDH )β⁃cateninp⁃p65/p65Control group0.25±0.040.52±0.0510mg /kg icariin group 0.16±0.051)0.45±0.061)20mg /kg icariin group 0.06±0.021)0.19±0.031)40mg /kg icariin group 0.03±0.011)0.06±0.021)Adriamycin group 0.01±0.011)0.03±0.011)Note:Compared with control group,1)P <0.05.2.5 淫羊藿苷对瘤组织中β⁃catenin㊁p65㊁p⁃p65表达水平的影响 Western blot结果显示:与对照组相比,不同剂量淫羊藿苷及阿霉素处理后癌组织中β⁃catenin蛋白表达水平及p65蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05)㊂见图5㊁表5㊂3 讨论淫羊藿又称为 仙灵脾”,最早记载于‘神农本草经“,具有补肝肾㊁强筋骨㊁祛风湿的功效,目前从淫羊藿中分离出的单体化合物的种类已超过260种,大部分为黄酮类化合物,其中淫羊藿苷含量最高[10]㊂现代药理研究结果表明,淫羊藿苷具有促神经突触生长㊁抗神经元损伤㊁促进骨代谢㊁抗炎㊁抗氧化应激㊁抗肿瘤等多种活性[11]㊂体外抗肿瘤活性实验发现,淫羊藿苷可以通过降低内质网应激相关分子表达,促进凋亡相关蛋白表达来降低人食管癌细胞增殖黏附能力[12];在卵巢癌中可以通过下调促癌基因RNA⁃21表达,促进抗癌基因PTEN㊁RECK蛋白表达抑制细胞增殖,加速细胞死亡[13]㊂本次研究通过注射人胰腺癌SW1990细胞株建立裸鼠移植瘤模型,并通过腹腔注射不同剂量淫羊藿苷来观察其体内抗肿瘤活性,结果显示,20mg/kg和40mg/kg 剂量的淫羊藿苷处理后,移植瘤的重量及体积显著降低,且小鼠存活率显著升高,但10mg/kg剂量的淫羊藿苷处理后,瘤体质量㊁体积及存活率与对照组相比没有明显差异,表明在体内淫羊藿苷同样具有抗肿瘤活性,且抗肿瘤活性具有浓度依赖性㊂同时本研究还利用TUNEL染色观察了瘤组织中癌细胞凋亡情况,结果显示20mg/kg和40mg/kg剂量的淫羊藿苷处理后,瘤组织中癌细胞凋亡率显著升高,表明淫羊藿苷可能是通过促进癌细胞凋亡来抑制肿瘤生长的,Wang等[14]研究发现在黑色素瘤小鼠模型中,淫羊藿苷主要通过调控细胞周期蛋白及凋亡相关蛋白来发挥抗肿瘤作用,与本研究结果相似㊂Ki67作为一种存在于增殖细胞核中的非组蛋白性核蛋白,与细胞周期高度相关,并且其在胰腺癌组织中的表达程度显著高于正常胰腺组织[15]; VEGF则能够增加血管的通透性,有利于肿瘤细胞浸入血管进而向淋巴及远处细胞侵袭转移[16],并且VEGF还可以诱导MMP的产生,而MMP又能够促进癌细胞对周围组织的浸润[17]㊂本研究利用免疫组化检测了瘤组织中Ki67和VEGF蛋白的阳性表达率,结果显示20mg/kg和40mg/kg剂量的淫羊藿苷处理后,瘤组织中Ki67和VEGF蛋白的阳性表达率均显著降低,表明淫羊藿苷抗肿瘤活性除了通过促进细胞凋亡实现外,还与抑制细胞增殖及其侵袭转移能力有关㊂利用qRT⁃PCR对瘤组织中细胞生长和运动基因进行分析发现,凋亡执行蛋白基因Caspase⁃3[18]相对表达量显著升高,上皮间质转化关键蛋白基因MMP⁃9的相对表达量降低,进一步证实了淫羊藿苷能够抑制肿瘤细胞生长及运动[19]㊂Wnt/β⁃catenin作为生物体内的一条高度保守的信号通路,在胚胎发育及维持细胞内稳态等生理活动中发挥着重要的作用㊂经典的Wnt/β⁃catenin 通路,主要通过β⁃catenin来传递信号,从而启动下游靶基因表达,β⁃catenin在肿瘤发展进程中发挥着两重功效,既可以通过与细胞膜上的E⁃cadherin结合,调控肿瘤细胞的侵袭转移,又可以作为Wnt/β⁃catenin的重要信号传递子,其浓度决定着Wnt/β⁃catenin通路是激活还是抑制[20,21]㊂NF⁃κB信号通路主要负责连接氧化应激和细胞凋亡过程,当机体出现氧化应激反应的时候,NF⁃κB会被激活进入细胞核中,通过与细胞凋亡基因c⁃myc等下游作用元件结合,促进细胞凋亡相关基因表达从而诱导细胞凋亡[22]㊂本研究结果发现,不同剂量淫羊藿苷处理后β⁃catenin蛋白表达以及NF⁃κB p65蛋白的磷酸化水平均显著降低,表明淫羊藿苷可能通过抑制Wnt/β⁃catenin和NF⁃κB信号通路活性,来调控肿瘤生长运动㊂综上所述,淫羊藿苷可能通过抑制β⁃catenin和NF⁃κB p65的活性下调增殖及运动相关基因表达,上调凋亡相关基因表达从而调节小鼠胰腺癌皮下移植瘤的生长和运动㊂淫羊藿苷作为天然抗肿瘤药物,具有很好的临床使用价值,但胰腺癌的发生发展还受其他信号通路调控,还需要继续深入研究㊂参考文献:[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CACancer J Clin,2013,63(1):11⁃30.[2] Chin V,Nagrial A,Sjoquist K,et al.Chemotherapy andradiotherapy for advanced pancreatic cancer[J].Cochrane Database Syst Rev,2018,3(27):CD011044.[3] 黄 祯,肖卫东.胰腺癌Wnt/β⁃catenin信号通路的研究进展[J].广东医学,2014,35(21):3445⁃3447.Huang Z,Xiao WD.Research progress in Wnt/β⁃catenin signaling pathway of pancreatic cancer[J].Guangdong Med J,2014,35(21):3445⁃3447.[4] 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喹叨啉衍生物在稳定DNA G-四链体及下调致癌基因c-myc中的作用欧田苗，Yu-Jing Lu，Chi Zhang，黄志纾，Xiao-DongWang，谭嘉恒，Yuan Chen，Dik-LungMa，Kwok-Yin Wong，Johny Cheuk-On Tang，Albert Sun-Chi Chan，古练权中山大学药学院，中国广州510080；国家医学和分子药理学重点实验室，中国深圳；香港理工大学应用生物学及化工系，药物发现及合成分子生物学技术研究所，中国香港。
接收日期：2006.8.22在特定癌基因的启动子区域稳定G-四链体的结构是抗癌药物设计的一个新兴领域。
人体的c-myc基因为癌基因，而G-四链体已被证明为该基因的转录控制元件。
本实验主要研究喹叨啉衍生物与c-myc基因G-四链体的相互作用。
实验结果表明，这些喹叨啉衍生物具有诱导/稳定c-myc基因G-四链体的作用，而G-四链体能下调c-myc在Hep G2细胞株中的表达。
实验发现侧链具有末端氨基的喹叨啉衍生物在无钾离子的条件下，可以特异性的结合双核苷酸loop异构体。
分子模拟实验揭示了喹叨啉衍生物与G-四链体的结合方式是通过3’位的末端堆叠。
除此之外，喹叨啉衍生物带正电荷的侧链对含拓扑四链的loop异构体的选择性及提高稳定性方面起到了作用。
1.简介人类的c-myc基因及其产物是细胞增殖和生长的调控中心。
C-myc的异常表达被认为与多种恶性肿瘤的形成有关。
位于c-myc的P1启动子区域上游中的核酶超敏感元件III1 (NHE a III1)控制着c-myc的80-90%的转录活性。
核酶超敏感元件III1是一个富G的含有27个碱基对的序列，可以形成分子内G-四链体结构并起到转录抑制因子的作用(图1)。
通过使用端粒酶抑制剂形成/稳定特定的G-四链体结构可以抑制c-myc基因的转录活性，如Telomestatin，TMPyP4，TMPyP4。
β-catenin过表达对骨肉瘤细胞TE85迁移、侵袭及凋亡的影响罗光金;康权;毕杨;迭小红;刘敏;仇超;罗庆【摘要】目的探讨β-catenin对骨肉瘤细胞TTE85迁移、侵袭及凋亡的影响.方法 RT-PCR及Western blot检测β-catenin在不同骨肉瘤细胞中的表达情况,重组腺病毒Adβ-catenin感染TE85细胞,RT-PCR及荧光素酶报告基因检测感染Adβ-catenin后β-catenin mRNA的表达及活性,划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力,DAPI染色和流式细胞技术检测细胞凋亡情况.结果 TE85细胞内源性β-catenin表达相对较低(P＜0.05),Adβ-catenin能显著增加TE85细胞外源性β-catenin基因表达及活性,β-catenin组细胞迁移能力明显减慢(P＜0.05),β-catenin组侵袭能力明显低于对照组(P＜0.05).结论β-catenin能抑制肿瘤细胞TE85的迁移及侵袭能力,对凋亡无影响.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)011【总页数】6页(P1491-1496)【关键词】β-catenin;TE85细胞;迁移;侵袭;凋亡【作者】罗光金;康权;毕杨;迭小红;刘敏;仇超;罗庆【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014;重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室,重庆400014【正文语种】中文【中图分类】R738.1目前有关Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤恶性生物学行为的影响存在不同的观点，传统的观点认为Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中处于激活的状态，抑制Wnt/β-catenin通路能抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、和促进凋亡[1-3]，而近年来有文献报道Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中处于失活的状态，激活Wnt/β-catenin信号通路能抑制骨肉瘤细胞增殖，且此信号通路活性的缺乏可能导致了骨肉瘤的发展[4]。
中山大学硕士学位论文β—咔啉生物碱作为DNA嵌插剂及ROS诱导剂的抗肿瘤机理研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：徐安龙;彭文烈20070606８－咔啉生物碱作为ＤＮＡ嵌捅剂及ＲＯＳ诱导荆的抗肿痛机理研究图２－３２０ｕＭ的ｐ咔啉生物碱处理２４ｈ后ＨｅｐＧ２细胞的形态。
（Ａ：对照组细胞，Ｂ～Ｉ．ＨｅｐＧ２细胞分别用化合物Ｃ一１ｓ，Ｃ－２４，Ｃ一２７，Ｃ－３１，Ｃ－３６，Ｃ一４７，Ｃ一牾，Ｃ－４９处理）２０ｕＭ口一ｃａｒｈｏｌｉｎｅＦｉｇｕｒｅ２－３ＰｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ．（Ａ：ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓ，Ｂ４：ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｍｐｏｕｎｄＣ一１８，Ｃ一２４，Ｃ－２７，Ｃ－３１，Ｃ－３６，Ｃ一４７，Ｃ－４＆Ｃ－４９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．）２．４．２ＭＴＴ法筛选结果与分析：２．４．２．１ｌ五９．三取代的Ｂ一咔啉生物碱衍生物的抗肿瘤活性：ｌ，２，９一三取代６．咔啉生物碱衍生物对５株肿瘤细胞株的ＩＣ５０值结果总结于表表２．３。
由表中结果可以看出，各个化合物均表现出一定的抗肿瘤活性，其中化合物Ｃ．３６，Ｃ．３７和Ｃ．４３活性较强，而以Ｃ．３６为最优，该化合物对５个细胞株的细胞毒性均在ｌＯｕＭ以下。
结合化合物的结构来看，表明９位上的苯丙基和丁基取代有利于化合物的抗肿瘤活性，其中，２位上为对甲基氯苯取代且９位上苯丙基取代显著的提高了化合物的抗肿瘤活性。
Ｂ一咔啉生物碱作为ＤＮＡ嵌捕剂及ＲＯＳ诱导剂的抗肿瘾机理研究化合物ＩＣ５０代号ＲｌＲ３Ｐ．７Ｒ９ｍＣ５０（ｕＭ）Ｃ－３８ＣＨ；ＣＨ２０ＨＨＣＨ３２２１．８３．６５Ｃ－“ＣＨ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２０ＨＨｎ－ＣｄＨ９１４０３．８５Ｃ．４５ＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）２Ｎｉｌ２ＨＣＨ２Ｃ６Ｈ５５８．７４．２３ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＣ．４６ＨＨｎ－Ｃ４Ｈ９９５．８４．０２Ｈ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＣ－４７ＣＨ３Ｈｎ－ＧＨ９２１．９４．６６Ｈ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＣ．４８ＨＨｎ－ＧＨ９８２．９４．０８Ｈ，ＣＯＮＨ（ＣＨＤ２ＮＣ．４９ＣＨ３ＨＣＨ２ＣｅＨ５３４．８４．４６Ｈ，Ｃ．５ｌＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ２ＨＣＨ２ｃ６Ｈ５１０４．３３．９８Ｃ一５２ＣＨ３ＣＨ２０ＨＨｎ．ＣｄＨ９１２７．６３．８９（２）分子叠合对优化好的化合物进行数据库的叠合，使用Ｓｙｂｙｌ６．９中的ＤａｔａｂａｓｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ命令。
八宝丹通过靶向Wnt-β-catenin通路抑制肝母细胞瘤增殖作用机制的研究摘要：肝母细胞瘤是儿童最常见的原发性肝肿瘤，治疗方法有限。
近年来，研究者发现Wnt/β-catenin通路在肝母细胞瘤中具有重要的作用。
八宝丹是一种以中草药为主要成分的中药方剂，具有抗肿瘤、抗炎等作用。
本研究旨在探究八宝丹对肝母细胞瘤增殖的影响以及其在Wnt/β-catenin通路中的作用机制。
通过体外细胞实验和体内小鼠实验，发现八宝丹能够明显抑制肝母细胞瘤细胞的增殖，同时降低Wnt/β-catenin通路的活性。
许多信号分子（包括GSK-3β和AXIN等）在Wnt/β-catenin通路中起着重要作用，研究发现八宝丹通过作用于这些信号分子，从而对Wnt/β-catenin通路产生了调节作用。
简而言之，八宝丹通过靶向Wnt/β-catenin通路抑制肝母细胞瘤的增殖。
关键词：八宝丹；肝母细胞瘤；Wnt/β-catenin通路；GSK-3β；AXI肝母细胞瘤（hepatoblastoma）是一种罕见的儿童恶性肿瘤，缺乏有效的治疗方法。
近年来，研究者发现Wnt/β-catenin 通路在肝母细胞瘤中具有显著的作用。
该通路调控肿瘤细胞的生长、增殖和转移能力，并且是肝母细胞瘤细胞的重要生长信号通路。
因此，靶向Wnt/β-catenin通路可能是治疗肝母细胞瘤的有效策略。
八宝丹是一种中草药方剂，具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等。
许多研究表明，八宝丹在抗肿瘤方面具有重要的作用。
然而，八宝丹是否对肝母细胞瘤有抑制效应，以及其作用机制仍然不清楚。
本研究使用体外细胞实验和体内小鼠实验探究了八宝丹在肝母细胞瘤中的作用。
实验结果显示，八宝丹能够明显抑制肝母细胞瘤细胞的增殖，同时降低Wnt/β-catenin通路的活性。
在分子机制方面，研究发现八宝丹通过作用于Wnt/β-catenin 通路中的信号分子，包括GSK-3β和AXIN等，从而对Wnt/β-catenin通路产生了调节作用，抑制了肝母细胞瘤的生长和增殖。
小檗碱衍生物B-119抑制肿瘤及血管内皮细胞增殖的作用林菁;祁蕙;庄铨坤;官夏露【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2012(046)002【摘要】Objective To investigate the effect of berberine derivate B-119 against the proliferation of tumor cells and against the proliferation, migration and tube-like structure formation of vascular en-dothelial cells. Methods MTT assay was applied to screen the anti-proliferative effect of B-119 on 8 kinds of tumor cell and ECV304 cells in vitro. The impact of B-119 on the migration of ECV304 cells was measured by scarification test, and the impact of B-119 on tube-like structure formation of ECV304 cells was examined under microscope. Results B-119 had different degrees of inhibition to these 8 tumor cell lines, and the IC50 of B-119 to these tumor cells were 0. 76~26. 83 mg/L. B-119 could inhibit the proliferation of ECV304 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner. After being treated with B-119 for 24 h, 48 h and 72 h, MTT assay showed the IC50 of B-119 to ECV304 were 59. 22, 12. 08 and 3. 31 mg/L respectively. The migration of ECV304 was reduced, and the inhibition effect of B-119 on ECV304 cells was strengthened with the increase of concentrations. After being treated with B-119 at the concentrations of 1.25 , 2. 5 and 5 mg/L for 24 h, the number of ECV304 cells migration was gradually decreased and the migration inhibition ratios were 49. 29%, 59.71% and 71. 94% respectively (P<0. 01). B-119 could inhibit the tube formation of ECV304 cells, After being treated with B-119 at the concentrations of 10, 20 and 30 mg/L for 18 h, the tube formation inhibition ratios were 35. 71%, 57. 14% and 67. 86% respectively (P<0. 01). Conclusions B-119 could inhibit the proliferation of 8 kinds of tumor cell and also inhibit the proliferation, migration and tube-like structure formation of ECV304 cells.%目的探讨小檗碱衍生物B-119对肿瘤细胞的增殖抑制作用及对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的影响.方法 MTT法检测B-119对瘤细胞株MDA-MB-231、B16、K562、LLC、HT29、SMMC-7721、Colo205、HL60和血管内皮细胞ECV304的增殖抑制作用;划痕法测定B-119对血管内皮细胞ECV304迁移的影响;观察B-119对血管内皮细胞ECV304小管形成的影响.结果 B-119对8株肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,IC50值为0.76~26.83 mg/L;B-119对ECV304的增殖抑制作用表现为时间、浓度依赖性,24,48,72 h的IC50分别为59.22,12.08,3.31 mg/L;药物干预组ECV304细胞迁移数减少,且随B-119浓度的增加,迁移抑制作用越强,B-119浓度为1.25,2.5,5 mg/L干预24 h后,细胞迁移数渐次减少,抑制率分别为49.29%,59.71%和71.94%(P<0.01);B-119对ECV304小管形成有明显的抑制作用,浓度为10,20,30 mg/L时的小管形成抑制率分别为35.71%,57.14%和67.86%(P<0.01).结论 B-119可抑制肿瘤细胞的增殖,并抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成.【总页数】5页(P95-99)【作者】林菁;祁蕙;庄铨坤;官夏露【作者单位】福建医科大学,药学院,福州,350004;福建医科大学,药学院,福州,350004;福建医科大学,药学院,福州,350004;福建医科大学,药学院,福州,350004【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R284.1;R329.2【相关文献】1.人参皂苷衍生物AD－1对肺癌A549细胞增殖和荷瘤裸小鼠肿瘤生长的抑制作用研究 [J], 龙浩2.灵芝β-葡聚糖磷酸化衍生物体外抑制肿瘤细胞增殖的作用 [J], 张忠; 张劲松; 唐庆九; 周帅; 杨焱; 冯娜; 王金艳; 刘艳芳K法检测紫草素及衍生物对血液肿瘤细胞株的增殖抑制作用 [J], 钟济华;成玲剑;周文;张义炜;钟华;黄洪晖;陈芳源4.TNP-470抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的作用机制 [J], 吴晓娟;杨向红;董玉兰5.氧化苦参碱对肿瘤诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用 [J], 王兵;王国俊;徐钧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
