双链DNA变性缓冲液

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为／L，加抽提液时，该系统的pH就高达，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。

它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。

用的NaAc溶液是为了把的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。

而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA 相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。

两步法pcr原理两步法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增DNA片段的分子生物学技术。

它主要由两个基本阶段组成：第一阶段是DNA的变性（Denaturation）和第二阶段是DNA的扩增（Amplification）。

两步法PCR通常由三个温度阶段组成：变性（95°C），退火（50-65°C）和延伸（72°C）。

在P C R过程中，需要以下关键成分：D N A模板，引物（p r i m e r s），D N A聚合酶，四种脱氧核苷酸（d N T P s）和缓冲液。

第一阶段，变性。

P C R反应体系中的温度升至95°C时，D N A双链分离。

这是通过加入热稳定D N A聚合酶——如T a q聚合酶来实现的。

T a q 聚合酶是一种从热泉中分离出来的热稳定酶，能够耐受高温，并在退火温度任然稳定的情况下加入。

第二阶段，退火。

一旦D N A双链分离，温度被降低到50-65°C。

在这个温度下，引物能够结合到D N A的单链上，在这个过程中引物起到了优化扩增D N A片段的作用。

引物可以在D N A模板上以互补碱基的形式结合，然后向前和向后移动，携带D N A聚合酶并将其定位到D N A的两端。

第三阶段，延伸。

在72°C的温度下，活性的D N A聚合酶将在D N A模板的引物的方向上合成新的D N A链。

D N A聚合酶使用单酷咪咪核苷酸（d N T P s）作为新的D N A链的组成单元，并在引物的指导下按照D N A模板的序列进行D N A的合成。

这个过程被重复多次来实现D N A片段的扩增。

每一个P C R循环都会导致指数级的D N A扩增。

这些循环通常会重复20-40次，每个循环包括变性、退火和延伸这三个温度阶段。

P C R结束后，扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测和分离。

pcr的变性温度一般为PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段。

在PCR过程中，变性是其中的一个关键步骤，它主要发生在变性温度下。

本文将介绍PCR的变性温度及其作用。

变性温度的定义和作用在PCR中，变性温度是指将DNA的双链分离为两条单链的温度。

变性温度是通过加热PCR反应液使DNA双链解开的过程实现的。

变性温度的合适选择可以确保DNA双链的完全解开，为后续的引物结合和扩增提供理想条件。

变性温度的选择变性温度的选择通常是根据待扩增的DNA片段的长度和组成来确定的。

对于大部分DNA片段来说，合适的变性温度一般在94°C到98°C之间。

这个温度范围可以保证DNA 双链的完全解开，使引物能够有效地与目标序列结合。

对于较短的DNA片段，可以稍稍降低变性温度，以减少PCR反应液的过热对于DNA片段的不良影响。

而对于较长的DNA片段，可以略微提高变性温度，以保证DNA 双链的充分解开。

影响变性温度的因素选择合适的变性温度需要考虑多个因素，如下所示：1.DNA片段长度：较长的DNA片段需要更高的变性温度，较短的DNA片段则相对较低。

2.DNA序列的碱基组成：不同的碱基组成对DNA的熔解温度有影响。

富含GC碱基的DNA片段通常需要更高的变性温度。

3.反应缓冲液的配方：不同PCR反应缓冲液中的成分含量和配比也会影响变性温度的选择。

4.引物设计：合适的引物设计也可以帮助确定合适的变性温度。

综合考虑这些因素，通过试验确定适宜的变性温度是非常重要的。

变性温度的控制PCR反应中的变性温度通常通过热循环的方式进行控制。

PCR仪会根据设定的程序自动升温到变性温度，保持一定时间以实现DNA的变性。

控制好变性温度可以确保PCR 反应的稳定性和成功率。

总结PCR的变性温度是将DNA双链解开为两条单链的温度。

选择合适的变性温度对于PCR的成功非常重要。

变性温度的选择需要考虑DNA片段长度、碱基组成、反应缓冲液配方和引物设计等多个因素。

DNA限制性内切酶——双酶切反应时通用缓冲液的选用
■当酶切位点确定后，最好购买同一家公司生产同一类型的内切酶（若酶切Buffer相同，这样有时候可以省去后期去需找酶切反应通用缓冲液）
■说明
使用两种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。

TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。

尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。

本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。

在本表中，各Universal Buffer之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。

TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。

终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。

■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。

◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。

◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。

试剂配制方法一、实验室常用储备液（1）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸）在700ml 超纯水中溶解186.1g Na2EDT A·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

用10mol/L NaOH调至PH8.0（约用10mol/L NaOH 50ml），补加超纯水至1L。

分装后高压蒸汽灭菌。

室温贮存。

注意：EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的PH值调至接近8.0，才会溶解。

（2）1mol/L Tri s·Cl将121.1g Tris碱溶于800ml超纯水中，用浓盐酸将PH值调至设定值。

PH值HCl7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml应使溶液冷却至室温后，方可最后调定PH值。

加超纯水定容至1L，分装后高压蒸汽灭菌。

如果配制的溶液呈现黄色，应予丢弃。

并使用质量更好的Tris。

Tris溶液的PH值因温度而异，温度每升高1℃，PH值大约降低0.03个单位。

（3）10mol/L 乙酸铵(NH4C2H3O2)将771g乙酸铵溶于800ml蒸馏水中，磁力搅拌至完全溶解，用蒸馏水定容至1L，过滤除菌，室温贮存。

乙酸铵在热水中分解，含有乙酸铵的溶液不能高压蒸汽灭菌。

（4）甘油（10％，V/V）用9体积的灭菌纯水稀释1体积的分子生物学级的甘油。

用0.22μm过滤器过滤除菌。

分装成1ml每份，-20℃贮存。

（5） 10mg/ml溴化乙啶(EtBr)在20ml双蒸水中溶解0.2g溴化乙啶，磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解。

然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，于4℃避光保存。

注意：溴化乙啶是一种诱变剂，必须小心操作。

（6） 70％乙醇（C2H5OH）100ml70ml无水乙醇溶于30ml蒸馏水。

（7） 50×葡萄糖Glucose（150ml储备液）将54g D-葡萄糖溶于超纯水，磁力搅拌至完全溶解，并将体积调至150ml，过滤除菌，室温贮存。

（8） 10mol/L氢氧化钠（NaOH）将400g NaOH颗粒，加入到一个约含有0.9L蒸馏水的烧杯中，磁力搅拌至完全溶解。

PAGE 电泳的操作步骤及试剂配方聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA 序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。

在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism ，单链构象多态性）。

原理：在SSCP 测定中，双链DNA （dsDNA ）被变性成为单链DNA （ssDNA ），每一条单链DNA 都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA 单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。

这些单链DNA 在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA 的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

SSCP 与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：a ．SSCP 使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。

我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺80g ，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺 2.76g ，10×TBE 50ml ，加水定容到1L ）b ．工作环境，由于SSCP 受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V ，电流50mA ，单板电泳功率为9W ，不用预热。

缓冲液最好用新配制的。

c ．由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。

室温在25。

C 以下。

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb 的DNA 片段和DNA 序列。

分析装载的样品容量大，可回收，DNA 纯度高。

在催化剂TEMED （N-N-N ，-N ，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。

1.1配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g 、N-N ，-亚甲双丙烯酰胺1g 、加水至100ML ，40C 棕色瓶可保存1.2配制5×TBE 缓冲液：TRIS 碱54克、硼酸27.5克、EDTA 3.72克、加水至1L 1.3制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积1.4DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp ）二甲苯氰FF溴酚蓝3.51000-20004601005.080-500260658.060-4001604512.040-200702015.025-150601520.06-10045122.聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤2.1从NaOH 池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶2.2把玻璃板拿到流动水处洗刷干净2.3洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干2.4用乙醇擦洗玻璃板试剂制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml ）3.5 5.08.012.020.030%丙烯酰胺11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE 20.020.020.020.020.010%过硫酸铵0.70.70.70.70.72.5带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）2.6面板在下，背板在上。

PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。

PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。

下面是PCR实验室操作的一般流程。

1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。

引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。

两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。

引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。

2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。

PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。

聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。

反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。

3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。

一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。

4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。

循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。

变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。

5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。

这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。

6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。

将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。

也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。

7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。

DNA电泳DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。

而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。

电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。

⑴DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

⑵DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。

常规电泳中质粒DNA 分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

⑶ 不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。

不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。

所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

⑷电场强度电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。

在精确测定 DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。

电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。

实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。

⑸溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。

当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。

pcr扩增目的基因的原理PCR扩增目的基因的原理引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可以扩增目的基因的DNA序列。

其原理基于DNA的双链结构和聚合酶的催化作用，在体外模拟DNA的复制过程，使得目的基因的DNA序列得以扩增。

本文将详细介绍PCR扩增目的基因的原理及其各个步骤。

一、PCR扩增原理：PCR扩增的原理基于DNA的双链结构和聚合酶的催化作用。

PCR 反应体系主要包括模板DNA、引物、核苷酸、酶和缓冲液等组分。

PCR反应通过不断循环的温度变化，使DNA的双链在高温下解链，然后在低温下引物与目的基因的互补序列结合，聚合酶在适温下催化新链的合成，从而实现目的基因的扩增。

二、PCR扩增步骤：1. 反应体系的准备：将PCR反应所需的核酸模板、引物、核苷酸、聚合酶和缓冲液按照一定比例混合，并搅拌均匀。

其中，核酸模板是待扩增的目的基因的DNA序列，引物是与目的基因的两端互补的短链DNA，核苷酸是DNA合成的原料，聚合酶是催化DNA合成的酶，缓冲液用于维持反应体系的pH值稳定。

2. Denaturation（变性）：将反应体系置于高温条件（通常为94-98℃），使DNA的双链解开，形成两个单链的DNA模板。

这一步骤是为了使模板DNA的两条链分离，为后续的引物结合提供单链DNA的模板。

3. Annealing（退火）：将反应体系降温至50-65℃，使引物与目的基因的DNA模板的互补序列结合。

引物的选择非常重要，它们必须与目的基因的两端互补，以确保引物能够特异性地结合到目的基因上。

4. Extension（延伸）：将反应体系升温至72℃，使聚合酶在适温下催化新链的合成。

聚合酶以引物为模板，合成与目的基因DNA互补的新链。

这一步骤是PCR反应的关键步骤，也是目的基因扩增的过程。

5. 循环反应：将上述三个步骤循环重复，通常需要进行20-40个循环，以扩增足够数量的目的基因。

三、PCR扩增的影响因素：1. 引物的设计：引物的选择非常重要，它们必须与目的基因的两端互补，且长度适当。

.；. 核酸电泳的双指示剂（溴酚兰和二甲苯青）与染色剂指示剂核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青。

溴酚兰在碱性液体中，呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb 的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。

指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。

载样缓冲液的作用有：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；③使样品呈色，使加样操作更方便。

琼脂糖电泳时往往在样品中同时加入这两种指示剂，溴酚蓝指示小片段DNA，二甲苯青指示大片段DNA。

PS：二甲苯青FF C25H27N2O6S2Na FW: 538.6用于琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶电泳的示踪染料, 易溶于水和醇，带电荷数少，移动速度慢。

染色剂核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。

溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。

注意：EB具有强致癌性，因此需要防止污染，避免皮肤接触，操作时要控制在划定的污染区，戴一次性塑料手套，废弃物妥善处理。

银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。