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检验技师考点：杂交瘤技术
检验技师考点：杂交瘤技术
杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。
筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。
把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。
原理：最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。
人源单抗制备比较复杂。
小鼠单抗的制备通常是使用Balb/c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。
大鼠的单抗制备通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤细胞。
B细胞是从免疫动物的'脾脏中分离出来的。
动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。
骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。
筛选的标准是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌;②是次黄呤鸟呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺激酶(TK)的缺陷型。
因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟(aminopterin)阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄呤(H)和胸腺(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡(图7—2)。
而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA.所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。
未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。
这就是用HAT培养基进行选择的原理。
杂交瘤技术流程引言：杂交瘤技术是一种重要的细胞和分子生物学研究方法，可以用于合成抗体、研究蛋白质功能以及筛选抗肿瘤药物等领域。
本文将介绍杂交瘤技术的流程，包括细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤等环节。
一、细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的第一步，旨在将抗体产生细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
具体步骤如下：1.1 收集抗体产生细胞和肿瘤细胞：抗体产生细胞可以来自小鼠或人类免疫系统，而肿瘤细胞则常使用骨髓瘤细胞等。
1.2 调整细胞浓度：将抗体产生细胞和肿瘤细胞分别离心，去除培养基，然后重新悬浮在含有多种营养物质的培养基中，使其浓度适宜。
1.3 细胞融合：将抗体产生细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合。
1.4 培养杂交细胞：将融合后的细胞放入含有适宜培养基的培养皿中，利用恒温培养箱进行培养，以促使杂交细胞的生长和繁殖。
二、筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞是为了从大量的融合细胞中筛选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：2.1 选择培养基：准备含有适宜培养条件的培养基，其中可能包含抗生素等物质以抑制非杂交细胞的生长。
2.2 稀释细胞：将培养皿中的杂交细胞适当稀释，使其分散在培养基中。
2.3 培养杂交细胞：将稀释后的杂交细胞转移到含有适宜培养基的培养皿中，继续在恒温培养箱中培养。
2.4 筛选条件：根据所需抗体的特性，设置相应的筛选条件，如添加特定抗原、采用酶联免疫吸附实验等。
2.5 筛选结果：通过观察培养皿中细胞的形态、颜色等特征，确定是否产生了目标抗体的杂交瘤细胞。
三、鉴定杂交瘤细胞鉴定杂交瘤细胞是为了确认所筛选出的细胞确实具有产生特定抗体的能力，并且可以稳定地传代。
具体步骤如下：3.1 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化，即分离成单个细胞，并分别培养在不同培养皿中。
3.2 培养单克隆细胞：将克隆化后的单克隆细胞继续在恒温培养箱中培养，观察细胞生长情况，筛选出生长良好的细胞。
杂交瘤细胞生成抗体技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程嘿，朋友！你知道吗？这杂交瘤生产单克隆抗体可真是个神奇又厉害的东西！咱先来说说这制备原理。
你就把它想象成一场细胞间的“相亲大会”。
B 淋巴细胞，就像是个敏感又多才多艺的家伙，能产生抗体，但是它命短啊，就像那一闪而过的流星。
而骨髓瘤细胞呢，就像个长生不老的“老妖”，能不停地分裂繁殖，可就是没那产生抗体的本事。
那怎么办？咱就让它们俩凑一块儿呗！这一凑，就好比牛郎织女相会，产生了杂交瘤细胞。
这杂交瘤细胞可不得了，既有 B 淋巴细胞产生抗体的能力，又有骨髓瘤细胞长生不老、不停分裂的本领。
这不就完美了吗？再来说说这技术流程，那也是步步精心啊！首先得准备好“原料”，把 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞养得壮壮的。
这就好比要做出美味的饭菜，得先有新鲜的食材不是？然后呢，让它们融合。
这融合的过程就像是搭积木，得小心翼翼，找准位置，才能搭得牢固。
融合之后，就得像选秀一样，把那些优秀的杂交瘤细胞选出来。
这可不容易，得经过一轮又一轮的筛选。
选出来之后，还得让它们大量繁殖。
这就像是种庄稼，得给足阳光、水分和肥料，才能有个好收成。
繁殖多了，还得提纯抗体。
这提纯的过程，就像是从一堆沙子里淘出金子，得有耐心，有技巧。
你说，这过程是不是既复杂又有趣？朋友，你想想，要是没有这杂交瘤生产单克隆抗体的技术，咱们在医学上得走多少弯路啊！很多疑难杂症可能就没法攻克，很多人的生命可能就没法挽救。
所以说，这杂交瘤生产单克隆抗体的技术，那就是医学领域的一把利剑，为我们披荆斩棘，带来希望！。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术对2019-nCoV抗体生产实验构想摘要：杂交瘤细胞是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。
杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备。
杂交瘤技术是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象，可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。
此次针对2019-nCoV进行杂交瘤细胞培养的实验构想。
关键词：2019-nCoV 杂交瘤技术单克隆抗体1.方法1.1细胞融合杂交瘤技术是在体细胞融合的技术基础上发展而来的，把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体，这种杂合体既能在体外培养中无限地快速增殖且存活，又能分泌单克隆抗体。
B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，最多存活两周便死亡；骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。
将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型：未融合B细胞，未融合骨髓瘤细胞，B细胞-B 细胞融合体，骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体，B细胞-骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞可大量繁殖并产生所需抗体。
1.2 HAT培养基筛选法细胞DNA合成途径分为主要合成和补救合成途径两种方式。
主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和胸腺嘧啶激酶将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成原料。
HAT培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶。
HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因，使得它们对HAT培养基敏感，阻断了DNA补救合成途径。
HAT培养基使未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。
它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910201070.6(22)申请日 2019.03.18(83)生物保藏信息CGMCC No.16695 2018.11.08CGMCC No.16696 2018.11.08(71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人 刘卫晓 金芜军 张哲 高进 董美 王迪 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务所(普通合伙) 11548代理人 李静(51)Int.Cl.C12N 5/20(2006.01)C07K 16/12(2006.01)G01N 33/569(2006.01)C12R 1/91(2006.01) (54)发明名称杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法(57)摘要本发明公开了杂交瘤细胞株1D11 1A5和2G41B8及其产生的抗体和制备方法。
所述杂交瘤细胞株于2018年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16696和CGMCC No.16695。
所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:768000和1:640000，抗体亚型分别为IgG2a和IgG1，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry2A蛋白及转基因水稻中的内源Cry2A蛋白，为转基因水稻中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
权利要求书1页 说明书7页 附图4页CN 109971726 A 2019.07.05C N 109971726A权 利 要 求 书1/1页CN 109971726 A1.杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2018年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16696和CGMCC No.16695。
