细胞转染的详细过程
1、准备工作如下：
1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)
从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。
细胞培养在适合的培养基中。
细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。
3)细胞在27℃孵育至少一小时。
4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合：
用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。
用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。
将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。
5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。
6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。
7)细胞在27℃孵育5小时。
8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。
9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。
2、第一代代病毒的收集与保存
1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。
2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。
3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。
3、病毒的保存
1)病毒存放于4℃避光保存。
2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。
3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。
4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。
4、杆状病毒的扩增
1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。
2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。
3)在每孔中加入适量的P1代病毒。
4)在27℃进行孵育48小时。
5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。
5、病毒空斑分析
1)准备工作如下：
澄清的杆状病毒保存于4℃
培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
病毒）。
-900ⅡSFM或者其他的适合的完全生长培养基。
4%琼脂糖凝胶。
灭菌细胞级蒸馏水。
灭菌玻璃瓶。
孔板（病毒的每一个滴度作一个平行）。
灭菌盖。
℃和70℃的水浴。
微波炉。
℃细胞培养箱。
2)收获sf9细胞，用Sf-900ⅡSFM将细胞稀释到5*105/ml共30ml。在2块6孔板中每孔加入2ml细胞。如果需要做负对照，则还需要一块新的6孔板。
3)细胞在室温孵育1小时，以便细胞在6孔板每孔的底部很好的贴壁。
4)孵育1小时之后在倒置显微镜下进行观察，sf9细胞应该覆盖50%的孔底。
5)用Sf-900ⅡSFM或者是其他无血清培养基对病毒进行稀释，稀释度为10-1-10-8，依次将0.5ml前一个滴度的病毒加入下一个盛有4.5ml培养基的12ml的一次性管子中。可次才用8个管子对病毒进行稀释（例如：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8）。
6)在6孔板上标记病毒的稀释度例如10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。
7)移去原有培养基，加入1ml相应稀释度的病毒。
8)细胞与病毒在室温下孵育1小时。
9)孵育1小时结束后，从40℃水浴中取出空斑培养基。
10)依次从病毒高稀释度到底稀释度，快速移去含有病毒的培养基加入空斑培养基。动作要迅速避免单层细胞干燥。
11)覆盖琼脂后，在室温下孵育10-20分钟，方可移动6孔板。
在27℃孵育7-10天直至空斑出现并计数。
