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Ｔａｑ酶专场－－我们也许天天都在ＰＣＲ但我们对Ｔａｑ酶知多少呢？第一节概述聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。
该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。
因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。
国内复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。
PCR发明不到10年，却已获得广泛应用。
目前，每年都有上千篇文章发表。
1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。
PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。
1993年度诺贝尔化学将已于10月13日揭晓，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。
现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。
taq酶测序原理
Taq酶测序是一种基于DNA聚合酶的测序方法。
Taq酶是一
种热稳定的DNA聚合酶，能够耐受高温条件下的DNA扩增
反应。
Taq酶测序的原理基于DNA链延伸和截断反应。
在Taq酶测序中，首先需要将待测DNA片段进行扩增，通常
使用聚合酶链反应（PCR）方法。
PCR使用一对引物（primers）在模板DNA的两侧进行扩增。
引物在反应体系中
的高温下与目标DNA片段特异性结合，并由Taq酶催化下的DNA聚合酶链扩增。
在扩增反应中，加入一种特殊的二进制链终止核苷酸（ddNTPs），它们是缺少3'羟基的核苷酸。
由于缺少3'羟基，当ddNTPs被加入新合成的DNA链上时，DNA聚合酶无法再
在其上继续延伸，导致链的突然终止。
经过多轮PCR反应，会产生一系列不同长度的DNA片段，每个片段以ddNTPs停止的位置为终点。
这些DNA片段随后可
以通过凝胶电泳进行分离，然后通过染料标记或放射性测定等方法进行检测。
通过对不同长度的DNA片段的测定，可以推断出原始DNA
片段的序列。
由于每个ddNTPs只能终止于特定的碱基，因此
可以通过测定每条DNA片段上的终止核苷酸来确定原始序列。
不同耐热聚合酶的比较：
Taq：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA片段。
扩增碱基出错率为10-5左右。
Pfu：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于Taq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。
Taq Plus：即扩增效率高和保真度好于一身。
扩增效率比Pfu高，保真度比Taq好。
能有效的扩增10kb以下的片段。
不同实验对酶的选择：
1.克隆普通长度的目的DNA片段（可选产品：Taq、Taq Plus）
2.保真度要求较高，片段比较短，如点突变、基因筛选等（可选产品：Pfu）
3.高保真长片段扩增，如构建基因图谱及分子遗传学研究等（可选产品：Taq Plus）
4.扩增GC含量较高或二级结构较复杂的模板（可选产品：Taq Plus）
5.实时荧光定量PCR反应（可选产品：Taq）
6.从菌株或质粒模板，筛选鉴定目的克隆，扩增6kb以下的片段（可选产品：Taq、Taq Plus、2×Taq PCR MasterMix）
7.模板比较复杂或目的片段丰度低，用普通Taq酶扩增不出条带（可选产品：2×Taq PCR MasterMix、2×Pfu PCR MasterMix
原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2008/t815105111.html。
〔PCR的循环参数〕1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
每完成一个循环需2～4分钟5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
taq dna的聚合酶酶促反应最不适的温度
【最新版】
目录
1.引言：介绍 Taq DNA 聚合酶
2.Taq DNA 聚合酶的反应温度
3.影响 Taq DNA 聚合酶反应温度的因素
4.最不适的温度对 Taq DNA 聚合酶的影响
5.结论：总结 Taq DNA 聚合酶的反应温度及其影响因素
正文
Taq DNA 聚合酶是一种常用于聚合酶链反应 (PCR) 的酶，它可以在高温下进行酶促反应，从而复制特定的 DNA 序列。
在 PCR 过程中，Taq DNA 聚合酶需要在不同的温度下进行反应，以便进行 DNA 的复制和扩增。
Taq DNA 聚合酶的反应温度通常在 50-75 摄氏度之间，这是因为在这个温度范围内，Taq DNA 聚合酶可以进行有效的酶促反应，同时也可以避免酶的变性和失活。
然而，具体的反应温度也会受到许多因素的影响，例如 DNA 模板的质量、引物的设计以及 PCR 反应的缓冲液成分等。
最不适的温度是指 Taq DNA 聚合酶不能进行有效反应的温度，通常是在高温或者低温条件下。
当温度过高时，Taq DNA 聚合酶可能会发生变性，导致酶失活，从而影响 PCR 反应的效果。
当温度过低时，Taq DNA 聚合酶的反应速率会受到影响，从而降低 PCR 反应的效率。
因此，对于 Taq DNA 聚合酶来说，选择合适的反应温度是非常重要的。
在实际的 PCR 反应中，科学家们通常会根据具体的实验条件和需求，选择最适合的反应温度，以获得最佳的 PCR 反应效果。
总的来说，Taq DNA 聚合酶的反应温度是影响 PCR 反应效果的重要因素之一。
pcr所用到的酶
PCR中使用的酶称为Taq酶。
Taq酶是一种分离自嗜热细菌的热稳定DNA聚合酶。
一般常用的Taq酶可以分为两种:rTaq酶和LTaq酶。
LTaq酶比rTaq 酶保真度更强，耐热性更好。
TaqDNA聚合酶用于PCR反应时，变性往往在94 ~ 95℃进行，这也是TaqDNA聚合酶进行30次或更多次PCR循环而不过度丧失活性时所能耐受的最高温度。
但是这种酶的保真度不高，因为这种酶的DNA聚合依赖于3’-5’的校正。
与常见的酶不同，用Taq酶扩增DNA往往会使片段的3’端突出一个A，这一点要注意。
这是因为TaqDNA聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性(延伸活性)，这导致在扩增的DNA片段的3’末端增加一个单个不成对的核苷酸。
taq酶的最适催化温度范围
摘要：
1.塔q 酶的概述
2.塔q 酶的最适催化温度范围
3.影响塔q 酶活性的因素
4.塔q 酶在不同领域的应用
正文：
塔q 酶，全称为热稳定DNA 聚合酶，是一种在高温环境中具有高效催化作用的酶。
在生物体内，塔q 酶起着至关重要的作用，它能够在高温条件下迅速复制DNA，为生物体提供生存所需的遗传信息。
塔q 酶的最适催化温度范围在70-80 摄氏度之间。
这意味着在这个温度区间内，塔q 酶的活性最高，能够最有效地催化DNA 复制过程。
值得注意的是，塔q 酶的热稳定性非常高，即使在高达95 摄氏度的温度下，也能保持一定的活性。
这使得塔q 酶成为研究高温生物体及其生态系统的重要工具。
除了温度，影响塔q 酶活性的因素还有酸碱度、盐浓度和底物浓度等。
在适宜的酸碱度和盐浓度条件下，塔q 酶能保持较高的活性。
而在底物浓度方面，塔q 酶的活性会随着底物浓度的增加而提高，但当底物浓度达到一定程度后，塔q 酶的活性不再随底物浓度的增加而提高。
塔q 酶在生物学、医学和工业等领域具有广泛的应用。
在生物学研究中，塔q 酶可用于研究高温生物体的基因组结构、复制机制和适应高温环境
的分子机制等。
在医学领域，塔q 酶可用于研究病原微生物在高温环境下的生存和繁殖规律，为传染病防治提供理论依据。
在工业领域，塔q 酶的高热稳定性使其成为生产高温酶制剂的重要资源，这些酶制剂可应用于食品、饮料、洗涤剂等高温加工过程，提高生产效率和产品质量。
总之，塔q 酶作为一款具有高效催化活性和热稳定性的酶，不仅在科学研究中具有重要意义，还在多个产业领域展现出广泛的应用前景。
高保真酶常见种类高保真酶是一类具有高精确度和高效率的酶，常用于分子生物学实验和工业应用中。
下面将介绍几种常见的高保真酶及其特点。
一、Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验中。
它是从热泛菌属中分离出来的，具有耐高温的特点，可在高温环境下工作。
Taq DNA聚合酶在扩增过程中能够准确复制DNA序列，具有较高的扩增效率和较低的错误率。
二、Pfu DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶是一种高保真酶，也常用于PCR扩增实验中。
与Taq DNA聚合酶相比，Pfu DNA聚合酶具有更高的保真度。
它来源于嗜热古菌属，能够在高温环境下工作。
Pfu DNA聚合酶能够准确复制DNA序列，不易产生错配碱基，因此在需要高保真度的扩增实验中被广泛应用。
三、Vent DNA聚合酶Vent DNA聚合酶也是一种高保真酶，适用于PCR扩增实验。
它来源于嗜热菌属，具有耐高温的特点。
Vent DNA聚合酶在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
四、Phusion DNA聚合酶Phusion DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验中。
它具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
Phusion DNA聚合酶是通过融合两种不同来源的酶而得到的，结合了这两种酶的优点，具有更高的扩增准确度和更低的错误率。
五、DeepVent DNA聚合酶DeepVent DNA聚合酶是一种高保真酶，适用于PCR扩增实验。
它来源于嗜热古菌属，具有耐高温的特点。
DeepVent DNA聚合酶在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA 序列。
六、AccuPrime Pfx DNA聚合酶AccuPrime Pfx DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验。
它在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
AccuPrime Pfx DNA聚合酶通过特殊的引物设计和酶的优化，能够减少非特异性扩增产物的生成，提高扩增准确性。
随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。
目前市面上有多种T aq 酶，能够满足多方面的实验需要。
那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。
高特异性Taq酶
高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。
这类酶最典型的代表是热启动T aq酶。
大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。
而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。
第一代热启动Taq酶往往直接在Taq 酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。
新一代的热启动Taq 酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar 系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。
此外，由于几乎所有的T aq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、（NH4）SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。
此外，热启动的T aq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。
如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，T aq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。
另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。
高保真Taq酶
下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。
普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。
其原理主要是因为高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。
需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。
目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通T aq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。
Clontech、LTI等公司都有此类产品。
如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4×10-6碱基/循环
数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。
高耐热性Taq酶
对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。
超长片段扩增Taq酶
对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech 公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。
关于复杂模板的扩增
对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。
QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。
关于条件的优化
现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。
但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。
以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。
我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。
