实验2-设计性实验-不同限制性内切酶对质粒切割-指导讲解

实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。

实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。

限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。

将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。

实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。

2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。

3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。

混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。

4. 制备1%的琼脂糖凝胶。

5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。

6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。

7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。

实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。

2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。

3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。

4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。

实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。

实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。

不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割摘要：【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。

【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。

【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。

【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。

关键词：限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱引言：没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。

限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。

限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

材料和方法：1．材料1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建1.2 限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司1.3 琼脂糖：进口分装2．设备2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。

3．试剂3.1 5 x TBE电泳缓冲液3.2 6 x 电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4℃；3.3 溴化乙锭溶液母液：将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温；3.4 DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

限制酶的多种切割方法 一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端 1. 单酶切 （1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。

这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。

（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。

有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。

2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。

有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。

常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。

【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。

③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。

（4）单酶切的优点与缺点。

单酶切优点就是操作简单。

它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。

不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割摘要:【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。

【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。

【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。

【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。

关键词:限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱1引言:没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。

限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。

限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

材料和方法:1(材料1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建1.2 限制性内切酶:EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司1.3 琼脂糖:进口分装2(设备2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。

23(试剂3.1 5 x TBE电泳缓冲液3.2 6 x 电泳载样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4?;3.3 溴化乙锭溶液母液:将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温;3.4 DNA分子量标准:从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法重组技术的关键工具。

并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具。

2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。

它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。

上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。

首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II 和 Hind III。

这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。

研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。

1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。

各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA 进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA 不能起作用。

这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型* Ⅲ型第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。

这类酶如 EcoB、EcoK 等。

第三类（III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

但这几个核苷酸对也不是特异性的。

因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。

不同限制酶切割目的基因和质粒
限制酶是一种能够识别并切割DNA的酶类，它们在基因工程领域中扮演着非常重要的角色。

通过使用不同的限制酶，我们可以切割出不同
的DNA片段，从而实现对基因和质粒的定向编辑和改造。

在基因工程中，我们常常需要对目的基因进行切割和重组，以实现对
其功能的调控和改变。

不同的限制酶具有不同的切割位点和切割方式，因此我们可以根据需要选择不同的限制酶来进行切割。

例如，EcoRI
限制酶可以切割出具有粘性末端的DNA片段，而BamHI限制酶则可以切割出具有平滑末端的DNA片段。

除了对目的基因进行切割外，限制酶还可以用于质粒的构建和改造。

质粒是一种常用的基因工程载体，它可以用于携带和传递目的基因。

通过使用不同的限制酶，我们可以将目的基因插入到质粒中，并实现
对其表达的调控和改变。

例如，pUC18质粒可以通过使用EcoRI和BamHI限制酶来进行切割和重组，从而实现对其载体能力和表达水平的调控。

总之，不同的限制酶在基因工程中具有非常重要的作用，它们可以用
于对目的基因和质粒进行切割、重组和改造，从而实现对其功能的调
控和改变。

在实际应用中，我们需要根据需要选择合适的限制酶，并进行精确的操作和控制，以确保实验的成功和可靠性。

不同限制酶切割目的基因和质粒在分子生物学中，限制酶起到了至关重要的作用。

限制酶是一类具有特异性识别和切割DNA序列的酶，能够定位并切割DNA分子中的特定碱基序列。

通过限制酶的切割，科学家们能够实现对基因和质粒的精确操作，进而实现对生物体的遗传信息的研究和调控。

1. 切割目的基因基因是生物体内负责遗传信息传递和功能表达的基本单位。

切割目的基因是通过限制酶切割来实现对该基因的操作，包括分离、提取、重组等。

限制酶的选择取决于目的基因的特定序列。

例如，对于目的基因中含有特定酶切位点的情况，我们可以选择限制酶来切割该位点，实现对目的基因的精确操作。

以限制酶EcoRI为例，EcoRI是一种常用的限制酶，它能够识别并切割具有序列5'-GAATTC-3'的DNA。

如果我们要切割一个目的基因，而该基因具有GAATTC序列，我们可以选择EcoRI来切割该序列，从而将目的基因切割出来。

这样一来，我们就可以对目的基因进行进一步的操作，如PCR扩增、测序等。

2. 切割质粒质粒是一种存在于细菌细胞中的环状DNA分子，具有自主复制的能力。

质粒在基因工程和分子生物学研究中起着重要的作用，可用于携带外源基因、表达蛋白等。

限制酶的切割可以使质粒在特定位置断裂，从而实现质粒的分离、提取和重组。

以限制酶BamHI为例，BamHI是一种常用的限制酶，它能够识别并切割具有序列5'-GGATCC-3'的DNA。

如果我们要切割一个质粒，而该质粒具有GGATCC序列，我们可以选择BamHI来切割该序列，从而将质粒切割成两个片段。

这样一来，我们就可以对质粒进行进一步的操作，如插入外源基因、构建重组质粒等。

通过限制酶的切割，科学家们能够实现对目的基因和质粒的精确操作。

这为基因工程、分子生物学研究和生物医学领域的发展提供了重要的工具和技术支持。

同时，限制酶的应用也需要科学家们对酶的特性和操作技术有深入的了解和掌握，以确保实验结果的准确性和可靠性。

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

三、操作步骤1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。

2. 酶切反应体系（10ul）：酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U) 底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）灭菌ddH2O 加至10 ul限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。

质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。

［实验原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。

细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。

它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。

由于细胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。

所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。

目前已发现的限制性内切酶有数百种。

EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断。

EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列的切口是：EcoRⅠ: G↓AATTCHind Ⅲ: A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

［实验器材］1.仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（100mL 或50mL），玻璃纸，一次性塑料手套。

pUC19（市售和自提），EcoRⅠ酶，λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。

2.试剂（1）TAE缓冲液（1×TAE）：称取Tris 4.9g、EDTA-Na2－2H2O0.74g，用900ml蒸馏水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最终用蒸馏水定容至1L。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

不同限制酶切割目的基因和质粒1. 引言限制酶是一类能够识别特定DNA序列并将其切割为特定碱基序列的酶类。

在分子生物学研究中，限制酶的应用十分广泛，尤其是在基因工程和重组DNA技术中。

通过选择不同的限制酶，可以实现特定目的的基因和质粒的酶切。

2. 酶切目的：基因克隆基因克隆是指从一个生物体中将目标基因分离出来，并将其插入到另一个生物体中的过程。

限制酶在基因克隆中起到了至关重要的作用。

通过选择适当的限制酶，可以将目标基因从DNA中切割出来，并插入到质粒中。

常用的限制酶有EcoRI、BamHI等。

这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。

通过酶切，可以得到具有黏性末端的DNA片段，这些片段可以与质粒上的黏性末端进行连接，从而实现基因的插入。

3. 酶切目的：基因敲除基因敲除是将特定基因从生物体的基因组中去除的过程。

限制酶也可以在基因敲除中发挥作用。

通过选择与目标基因相邻的限制酶切割位点，可以将目标基因切除，并使其失去功能。

常用的限制酶有EcoRV、HindIII等。

这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。

通过酶切，可以得到缺失目标基因的DNA片段，从而实现基因敲除。

4. 酶切目的：基因定点突变基因定点突变是指在特定位点上引入特定的碱基改变。

限制酶也可以在基因定点突变中发挥作用。

通过选择与目标位点相邻的限制酶切割位点，可以将目标位点切除，并插入带有特定碱基改变的DNA 片段。

常用的限制酶有PvuII、SmaI等。

这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。

通过酶切，可以实现基因定点突变。

5. 酶切目的：质粒构建质粒构建是指将目标基因插入到质粒中，构建重组质粒的过程。

限制酶在质粒构建中也起到了关键作用。

通过选择适当的限制酶，可以将目标基因从DNA中切割出来，并插入到质粒中。

常用的限制酶有XbaI、PstI等。

这些限制酶能够识别特定的DNA序列，并将其切割为特定碱基序列。