流式细胞仪上机培训手册(仅供参照)

流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。

本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。

阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

目录第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第 4章光电系统………………………………………………………………4.1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4.4 阈值………………………………………………………………第 5章数据分析………………………………………………………………5.1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………5.7 Simultest 软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5.10 FACSPress软件使用…………………………………………5.11 System II软件使用…………………………………………5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………5.13 Modfit使件使用……………………………………………第 6章流式基本检测项目6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………6.3 血小板抗体检测………………………………………………6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………6.5 干细胞检测……………………………………………………6.6 DNA倍体分析……………………………………………………6.7 凋亡检测…………………………………………………………第 7章分选6.1 分选………………………………………………………………第 8章激光器及光路校正……………………………………………………7.1 激光器的工作原理………………………………………………7.2 光路校正…………………………………………………………第 9章答案………………………………………………………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。

BD-FACSCalibur流式细胞仪培训手册BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。

2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。

3. 开启计算机。

4. 确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。

5. 将废液倒掉，并在废液筒中参加200ml 家用漂白水(废液筒容量为4L)。

6. 将减压阀方向调在加压〔Pressurize〕位置。

7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。

8. 取下样品管，执行PRIME 功能两次。

9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。

10. 可开始分析样品。

2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。

1. 将样品支持架左移，取2 mlFACSClean〔10%Bleach〕上样品，让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。

2. 将样品支持架回正，按HI RUN，然后让FACSClean 清洗管路10分钟。

3. 按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。

4. 取2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。

5. 注意最后只留约1 ml dH2O 在试管中。

6. 按STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪〔必要动作，以保护雷射光源。

〕7. 倒掉废液，并回填200 ml漂白水。

8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。

将鞘流液筒充填至八分满。

9. 退出软件“File〞→“Quit〞(如有对话选项，选择“Don‘t save〞)。

确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。

10. 关闭计算机。

“Special〞→“Shutdown〞。

三、上机分析流程建议首次试机防止进行大量试验，仅需准备以下样品。

〔1〕Negative Control〔不加任何抗体〕。

BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。

如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。

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一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：LO：样品流速：12 μl /minMED：样品流速：35 μl /minHI: 样品流速：60 μl /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。

（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。

）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。

•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。

PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。

请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

流式细胞仪培训流式细胞技术流式细胞技术是一种定量分析技术。

定量测量在细胞生物学中之所以重要，是因为要想鉴别出一个细胞群体，主要是依据细胞特殊标记物的数量，而不仅是依据标记物的存在与否。

多参数相关分析可以对细胞固有的性质，例如光散射的测量与定量测定细胞的特征如表面受体、和DNA 同时进行。

当然，必要时还可同时再测定胞浆内抗原、核内抗原等等。

这样，就有可能从一个复杂的细胞混合体中，识别出某一个特定的细胞亚群。

由于只有对大量的细胞进行测量才能发现稀有的亚群并把它分选出来，所以快速测量是必需的。

这里所谓分选即流式细胞分选术，是根据所测定的各种细胞性质的不同组合，从细胞群体中将某个亚群分选出来，以对它进行功能研究、形态学研究、进一步培养或做其它的分析。

流式细胞仪的工作原理流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。

流式细胞仪一般都包括液流系统、光学系统和电子系统，某些机型还可选配分选系统。

待测样本中的细胞经液流系统传送依序地通过流式细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发产生信号，被信号接收器接受并放大，这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。

流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。

光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。

依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。

用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的平衡缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过激光照射区 (液柱与入射的激光束垂直相交点称为检测区)，被荧光染色的细胞受强烈的激光照射后发出各色荧光，同时产生光散射。

流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1)取样。

取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2)编号。

根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a)1号管：相应同型对照；b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3)加样。

用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4)洗涤。

加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5)染色。

弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。

）6)洗涤。

加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7)重悬。

弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCantoII或BD Accuri C6)。

（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。

）8）试验结果分析。

（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。

参考值：二、上机检测BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪1 打开流式细胞仪电源2 启动计算机，打开软件登录3 确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer > connect检查液体水平1 启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。

3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。

检查气泡1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。

2 如果没有看到气泡，进行第5步。

如果看到气泡，点击Cytometer > CleaningModes >De-gas Flow Cell.3 当完成信息出现后，点击OK。

目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition） (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控－运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习：数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习：数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating（画门） (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)7.4.1 分辨率（CV） (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。

BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。

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一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：LO：样品流速：12 μl /minMED：样品流速：35 μl /minHI: 样品流速：60 μl /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。

（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。

）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。

•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。

PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。

请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

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一、BD FＡCＳCａｌibｕr基本结构1、1仪器本体:１。

电源开关:在BD FAＣSCalｉｂｕｒ仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。

2。

光学系统:BD FＡCＳＣａｌibur基本配有一支波长4８8 ｎm 得氩离子雷射以BD FACSCａｌｉｂｕｒ基本型为例➢ＦSC Diode 只收48８ nｍ波长散射光➢SSCＰMT 只收488 nm波长散射光➢ＦL１PMＴ荧光光谱峰值落在绿色范围(波长51５—545 nｍ)➢FＬ2PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564—60６ｎm)➢ＦＬ3 ＰＭT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>６5０nm)3. 仪器面板:仪器前方面板得右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制:ＬO: 样品流速:12 μl/mｉnＭEＤ:样品流速:35 μl /ｍiｎHI: 样品流速:6０μl /ｍｉn功能控制:•ＲUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。

(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查就是否失压、)•STAＮDBＹ:ﻩ无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低、•ＰRIME:去除流动室中得气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。

ＰRＩME结束,仪器恢复STAＮDBY状态。

4、储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Aiｒｆiｌter、请注意气路减压阀VENTＴOGGLE之位置、•鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升、装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约３小时。