葛根素注射液—葛根素的测定—高效液相色谱法

高效液相色谱法测定葛根芩连片中的葛根素王海鸣;严志红【摘要】HPLC method was established for the determination of puerarin in Gegenqinlian tablet. The sample was extracted by ultrasonic with50%methanol and extraction time of 20 min. The diamonsilTM C18 (250 mm ×4.6 mm 5μm) column was used with methanol–acetonitrile–water (volue rate was 8∶12∶80) as the mobile phase,the flow rate was 1.0mL/min,detection wavelength was 250 nm,column temperature was30.0℃and injection volume was 10μL. HPLC method could completely separated puerarin from other substances under the optimum experimental conditions. The concentration of puerarin was linear with peak area in the range of 5.43–543.2μg/mL,the linear correlation coefficient was 0.999 9,and the detection limit was 3.50 μg/mL. The average recovery of method was 100.0%and the relative standard deviation was 1.6%(n=6). The method is simple,rapid,reproducible,and it is suitable for the determination of puerarin in Gegenqinlian tablet.%建立高效液相色谱测定葛根芩连片中葛根素含量的方法。

高效液相色谱法测定双葛止泻口服液中葛根素的含量朱华伟1，周冰1，李焕娟1,李传栋2，张聪1，周德刚1*（1.洛阳惠中兽药有限公司河南洛阳471000；2.河南新正好生物工程有限公司郑州450000）试验旨在建立双葛止泻口服液中葛根素的含量测定方法。

试验用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm ，5μm ），以甲醇-0.4%磷酸溶液（24∶76）为流动相；检测波长为250nm ；流速为1.0mL/min ；柱温为30℃。

结果表明，葛根素进样量在0.1616～1.6159μg 的范围内线性关系良好（r=0.9999），回收率的平均值为100.5%，RSD 为0.8%。

因此，该方法准确度高、专属性好，可用于双葛止泻口服液中葛根素的质量控制。

葛止泻口服液；葛根素；高效液相色谱法双葛止泻口服液是由金银花、葛根、黄芩、黄连等中药组成，采用提取、纯化技术，加入适宜的辅料，灭菌而制成的口服液制剂。

本方来源于《伤寒论》中的经典方剂“葛根芩连汤”，通过组方加减，工艺优化而制成的新型中兽药制剂，为农业农村部批准的国家三类新兽药（农业农村部公告第186号）。

本方具有清热燥湿，解毒止泻的功效，用于仔猪湿热泄泻。

方中金银花清热解毒、疏散风热，葛根解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络，二者共为君药。

研究表明，本品具有一定的抗炎止泻作用，其止泻机制与抑制胃肠运动具有相关性[1]，且本品对麻鸡大肠杆菌病具有良好的治疗效果[2]。

方中金银花的化学成分主要为黄酮类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类和有机酸类等[3]，葛根的化学成分主要为葛根素、大豆苷元和大豆苷等异黄酮类化合物，香豆素类及三萜及三萜皂苷类成分，此外还有丰富的矿物质和氨基酸[4]。

公司已建立该产品中指标成分绿原酸的含量测定方法[5]，为了更好地控制该产品的质量，本文采用高效液相色谱法，建立了本品中葛根素的含量测定方法，并对该方法进行了系统的方法学研究，以期为该制剂的质量控制提供依据。

山东省药品检验所250012葛根素注射液为新型血管扩张药，用于冠心病、心肌梗塞、心绞痛的治疗，其主成分葛根素为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 的干燥根中提取、分离得到的以葛根素为主的异黄酮苷类，其含量测定方法，卫生部药品标准(试行)［1］为紫外分光光度法。

在生产和检验过程中发现，按100 %投料，紫外法测定其含量可达标示量的103 %左右，经薄层检查，其原料葛根素含杂质，易导致注射液测定含量偏高。

本文采用高效液相色谱法，使葛根素与杂质得到良好分离后，测定葛根素的含量，其方法准确，结果可靠。

1 仪器与试药TSP高效液相色谱仪(包括P 2000泵，AS 3000自动进样器，UV 2000检测器，IBM 350—450 DX2数据站)。

葛根素对照品(中国药品生物制品检定所提供)；对-羟基苯甲醛内标物(山东省药物研究所精制，色谱纯)。

乙醇(优级纯)，重蒸馏水，丙二醇(分析纯)，葛根素注射液(烟台中策药业有限公司提供)。

2 色谱条件色谱柱：Turner C18H37，5 μm 4.6 mm×150 mm；流动相：乙醇—水(43∶207)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm；理论板数按葛根素计，不低于3000，与内标峰分离度大于5。

3 线性关系试验取对-羟基苯甲醛适量，加流动相制成0.5 mg/mL的内标溶液。

取105 ℃干燥至恒重的葛根素对照品适量，精密称定，用流动相溶解，制成0.3 mg/mL的溶液，精密取该溶液1、3、5、10、20 mL，分别精密加入内标溶液10 mL，摇匀，取各溶液10 μL进样，记录色谱图(见图1)。

以葛根素峰面积和内标峰面积之比Y与浓度X(mg/mL)做线性回归，得回归方程为：Y＝11.98X+5.673×10-3r=0.9991即葛根素在0.027～0.2 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

图1 色谱图1.葛根素2.内标3～6.杂质4 校正因子的测定取在105 ℃干燥至恒重的葛根素对照品约20 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，精密取该溶液与内标溶液各10 mL 混匀，取10 μL进样，记录色谱图，按对照品与内标的峰面积比计算校正因子。

葛根含量测定方法（葛根素）葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。

2005版《中国药典》一部采用高效液相色谱法测定其葛根素的含量。

一、高效液相色谱法2005版《中国药典》葛根含量测定项下：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（25：75）为流动相；检测波长为250nm。

理论板数按葛根素峰计算应不得低于4000。

供试品溶液的制备：取本品粉末约0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

HPLC法测定葛根及其制剂中葛根素的含量时，使用最多的流动相系统为甲醇-水系统，另外还有甲醇-水，加醋酸调节pH等。

A：以甲醇-水为系统的，常见的比例及实验条件为：①Waters2695/ 2996/ Empower 色谱系统；色谱柱Symmetry C18 柱( 3.9mm×150mm, 5μm)；流动相：甲醇-水(25：75)；DAD检测波长254nm；柱温35℃。

②SP8800 型高效液相色谱泵；Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5μm大连依利特科学有限公司)；流动相：甲醇-水(30：70)；柱温40℃；检测波长250nm。

③Waters高效液相色谱仪；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；甲醇-水（40：60）为流动相；检测波长为250nm；柱温30℃。

④美国Spectra-Physics 液相色谱仪；色谱柱Lunm C18 (150mm×4.6mm, 5μm ) 不锈钢柱(美国Phenom enex 公司)；流动相为甲醇-水(28：72)；检测波长250nm；柱温30℃。

B：乙腈-水系统：①LC-10ATvp高效液相色谱仪；Hypersil ODS 色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)；乙腈-水(15：85)为流动相；检测波长250nm。