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基因编辑技术和原理 ppt课件

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基因组编辑技术 ppt课件

基因组编辑技术 ppt课件
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CRISPR-Cas主要由两部分组成：
CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌 基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组 成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间 隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶 基因进行识别。
域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp， RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成 双链的断裂。
25
CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能 够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读 框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而 HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA 模板存在时对靶位点进行可预测的插入。
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Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链
DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位 点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并 不需要形成二聚体才能发挥作用。
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CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来 的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成， 其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切 割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单 元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设 计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜 力。

基因编辑技术PPT课件

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GAATTC
AGATCT
CTTAAG
TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT
A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
CELLECTIS S.A. NASDAQ
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
基因组编辑技术简介
Genome Editing
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
第一节 基 本 概 念
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
植物遗传转化方法和技术
根癌农杆菌介导的植物转基因
图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图
基因枪介导法 电转化法 PEG转化法 花粉管通道法
动物遗传转化方法和技术
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法 病毒载体法
SUCCESS
THANK YOU
2019/8/9
基因重组/敲除的概念及简史
1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠 定了基因重组/敲除的技术基础
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体
技 外显子插有新霉素抗

crispr-cas基因编辑技术原理与应用PPT精选文档

crispr-cas基因编辑技术原理与应用PPT精选文档
力因子测试和MLST 基因型明显相关。
31
进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
32
进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
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基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
33
进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
34
进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是

《基因编辑新技术》课件

《基因编辑新技术》课件
• 基因疾病的治疗 • - 临床案例：ADA - S C ID • 癌症治疗方案 • - CA R - T细胞治疗 • - 基因修复及监测
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望

6.基因组编辑技术专题 ppt课件

6.基因组编辑技术专题 ppt课件

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶 Emmanuelle Charpentier
ppt课件
23
1 CRISPR-Cas系统的发现 免疫过程
ppt课件
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1 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间
隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，细菌进化了CRISPR 介
ppt课件
1
• 自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通 过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。
1973年，斯坦利·N·科恩(Stanley N. Cohen)和赫伯特·W·博耶 (Herbert W. Boyer) 成功将蛙的DNA插入到细菌中。
20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造， 使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿 病的胰岛素。
2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因 组编辑。
3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定位到靶DNA处。
4） CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列 后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱 基就可以出现一个NGG。
导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，
即通过增加或删除间隔序列（spacer）pp来t课实件 现的。
25
1 CRISPR-Cas系统的发现
• CRISPR/Cas系统分类：根据CRISPR—Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性， 可将CRISPR—Cas系统区分成3种类型：

基因编辑技术PPT(完美版)

基因编辑技术PPT(完美版)
是感染细菌的一类病毒 ，寄生于细菌中，并能溶解 细菌细胞，故称噬菌体。
噬 菌 体 生 活 周 期
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
第五节 重组DNA技术
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组， 可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获 得目的基因。
2； 待测DNA序列使用M13噬菌体。
3、目的基因与载体的连
接
原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
3、常用载体
质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
1、质粒（plasmid）:
质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

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5
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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1
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
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成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
2020/12/27
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基因编辑的研究背景
• 传统的动物育种方法受到种源的限制， 其程需要耗费大量的人力、物力和财力，经 历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很 困难，育种成果很难取得突破性进展。
2020/12/27
3
基因编辑原理
•
现代基因组编辑技术的基本原理是
相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂激
2020/12/27
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基因编辑原理
2020/12/27
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基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like
链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同
的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一
般为12~20 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个
碱基为 T 时其结合效果更佳。
2020/12/27
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3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
9
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末 端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位 点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
• 目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植
物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有 较大的应用优势， 但仍然有些问题需要解决，例如:脱 靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置 及邻近序列有关等。
2020/12/27
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• 1987年，Ishino 等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因
附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复 序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十 年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌获
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
2020/12/27
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TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE
array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶
标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形
成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双
活细胞天然的修复机制，包括非同源末
端连接和同源重组修复 两条途径。
2020/12/27
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• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修 复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因编辑技术和原理
2020/12/27
1
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技 术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点 上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片 段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑 了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。
effector nucleases，TALEN)技术； RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas 9）。
2020/12/27
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1. ZFN 基因组编辑技术
• ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具
有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年
2020/12/27
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2. TALEN 基因组编辑技术
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后 ，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的 锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比 ZFN 更广阔的应用潜力。
Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现
了Cys2- His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌
指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指
连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
2020/12/27
2020/12/27
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• ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位
点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷 制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表 达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异 性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。
基因敲入。
（ 移码突变：在正常DNA分子中，碱 基缺失或增加3的倍数，造成这位置之后
的一系列编码发生移位错误的改变，这 种现象称移码突变。）
2020/12/27
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• 2. 同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修 复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下 ，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的 整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如 果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在 的情况下，可以进行原基因的替换。