DNA扩增试剂盒(恒温扩增法)

恒温扩增技术在分子诊断中的应用摘要：既往临床诊断中主要对聚合酶链反应（PCR）技术进行应用，但其存在一定程度的缺陷，而恒温扩增技术因为具有引物种类的多样性，所以检测方法相对多变，能够对传统PCR中存在的缺陷有效弥补，并在分子诊断工作中得到了广泛应用。

关键词：恒温扩增技术；分子诊断；应用相对于常规PCR技术，对恒温扩增技术进行应用，其不仅不需要应用专门的仪器，且更加的快速和高效。

当前广泛应用的恒温扩增技术主要包括依赖核酸序列扩增（NASBA）、转录介导扩增（TMA）、环介导等温扩增（LAMP）等多种形式，其各具优缺点，且能够在分子诊断工作之中起到不同的作用。

一、依赖核酸序列扩增（NASBA）NASBA是主要适合应用于RNA的扩增之中，针对体外特异、连续均一且引物介导的单链RNA实施恒温扩增，需要于42℃的环境中使用两个小时左右的时间，将模板RNA扩增至其109——1012倍。

对NASBA进行应用：（1）在NASBA电化学发光技术检测法方面，需要对电化学发光技术原理进行应用，针对RNA产物实施检测工作，完成扩增反应以后，使用经过生物素标记的探针与RNA产物结合形成复合物，并由寡核苷酸饱和磁珠携带至电极处，受到低电压影响，钌离子能够出现氧化还原反应并产生光子，并于三丙胺作用下再生，可见电极处的RNA产物与光信号强度具有密切关联性，二者呈正相关关系，所以可以通过电化学发光检测技术对620nm位置的发光强度进行检测并明确RNA定量；（2）核酸杂交检测法的应用，将NASBA为基础结合原位杂交技术形成原位NASBA，使用原位杂交技术探针及RNA扩增产物进行杂交，再使用紫外分光光度计对探针量进行监测，可以实现RNA产物的定量分析工作[1]。

二、环介导等温扩增（LAMP）LAMP属于一项新型的核酸扩增技术，其具有扩增效率较高的特点，其扩增效率最高能够达到普通PCR的100倍左右，同时特异性较强，并且所需的反应时间较短，一般30——60min即能够实现一次扩增反应，在临床样本量大时，可以实现快速的检测，另外，对LAMP进行应用的成本相对较低，仅需恒温器即可。

REPLI-g Mini Kits 试剂盒说明书纯化基因组DNA的扩增●本协议优化了大于10ng的纯化基因组DNA模板的全基因组扩增。

DNA模板应该在TE内悬浮，如果DNA是高质量，可以运用起始材料的更少量（1-10ng）。

●血液的直接扩增见14-16页。

●为了获得最好的结果，大于10kb的DNA模板的某些片段长度应该大于2kb。

●REPLI-g Mini DNA聚合酶应该在冰上解冻。

其他所有的化合物成分可以在室温解冻（15-25℃）。

●Buffer D1和Buffer N1储存时间不应该超过3个月。

●如果DNA模板应用量是2.5ul，遵从蓝色的文本，标有蓝色三角形▲。

●如果DNA模板应用量为5ul，按照红色文本，红色实心圆●。

开始前小贴士●添加无核酸酶水500ul于Buffer DLB中，并涡旋混匀和短暂离心。

注：重新配置的Buffer DLB可以在-20℃储存6个月，Buffer DLB的PH不稳定，要避免该试剂与二氧化碳反应。

●所有的缓冲溶液和试剂在使用前都应该涡旋，目的是试剂充分混合。

●水浴锅30摄氏度。

步骤：1.准备足够的Buffer D1（变形溶液）Buffer N1（中和反应溶液）以满足全基因组扩增反应的总数量（见表1）。

注：表中1给出的Buffer D1 和Buffer N1 的总体积最多适用于▲15或7●个反应。

Buffer D1和Buffer N1储存时间不应该超过3个月。

表1 Buffer D1和Buffer N1的准备组分Buffer D1 Buffer N1 重建的Buffer DLB 9ul -终止溶液- 12ul无核酸酶水32ul 68ul总体积41ul 80ul2.放2.5ul▲和5ul ●的DNA模板到微型离心管内。

注：DNA模板的总量应该大于10ng，3.加入2.5ul▲和5ul ●的Buffer D1到DNA，涡旋混匀并短暂离心。

4.室温放置样品3min。

5.再加入5ul ▲和10ul ●的Buffer N1到样品中，涡旋混匀和短暂离心。

交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良【摘要】目的：探讨交叉引物扩增技术（CPA）快速检测系统在结核病诊断中的价值。

方法收集唐山市第四医院2015年3～5月206例结核病就诊患者的痰液标本，其中肺结核患者95例（其中痰涂片阳性26例，阴性69例），非结核患者111例，分别采用RT‐PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法（RT‐PCR）检测标本中的结核分枝杆菌，对结果进行统计分析。

结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT ® TB‐CPA 法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27．37％（26／95）、50．53％（48／95）、56．84％（54／95）、51．58％（49／95）。

以罗氏培养结果为诊断金标准，EasyNAT ® TB‐CPA 法灵敏度为89．58％（43／48），特异度94．94％（150／158）；RT‐PCR法的灵敏度为83．33％（40／48），特异度94．30％（149／158）；EasyNAT ® TB‐CPA与RT‐PCR法相比，总体一致性为98．54％（203／206）， Kappa指数值为0．92。

结论TB‐CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值，且方法简便、快速。

【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2016(013)008【总页数】3页(P1107-1109)【关键词】结核分枝杆菌;恒温扩增;培养法;交叉引物扩增技术【作者】毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良【作者单位】河北省唐山市第四医院 063001;河北省唐山市第四医院 063001;华北理工大学附属医院，河北唐山 063009;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市滦南县医院 063500【正文语种】中文结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球最具威胁的传染病之一。

通用型RT-LAMP反应液试剂盒使用说明书1.产品编号：LR0012.产品规格：25次3.中文名：通用型RT-LAMP反应液试剂盒4.技术背景：环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。

反应的过程主要分为循环扩增反应起始物的形成和循环扩增反应。

其基本原理是采用4/6条特异引物和具有链置换功能的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增。

目前，该技术已经应用于人类及动植物细菌、真菌、寄生虫、病毒等病原体的快速检测。

LAMP技术具有下面的优点：1）在恒温的条件下实现核酸的扩增，不需要热循环仪；2）特异性高，采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域；3）扩增速度快，效率高，可在30-60min内获得结果；4）结果判定简单，无需电泳即可实现肉眼可见的扩增效果。

5.适用范围：可用于一切与LAMP相关的快速RNA等温扩增技术。

6.组成及保存条件：7.使用方法：使用时，取17.6 μL RT-LAMP反应液，加入LAMP DNA 聚合酶、反转录酶、引物、模板，并加入无核酸酶H2O补足体积至25μL即可进行反应。

8.反应举例：注意：以下举例多数情况下可供参考。

实际反应条件因模板、引物等的不同而有所差异，应根据实际情况，设定最佳反应条件。

制备反应液：融解RT-LAMP反应液，混匀，短暂离心。

在反应管中加入以下组分：*：实验引物、模板自备，加入量根据实际引物、模板浓度确定。

如在反应管中加入SYBR Green Ⅰ1µL，可直接在荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。

等温扩增：混匀，置于60～65℃保温30～90min，80℃10min灭活LAMP DNA 聚合酶，产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。

扩增产物的检测：向扩增管中直接加入1µL的显色剂，混匀，观察颜色的变化，阳性样品变呈浅绿色，阴性样品仍为橙色。

交叉引物恒温扩增技术随着科学技术的不断进步，人们的实验室实践也不断得到更新发展。

其中，分子生物学领域的实验技术，也一直在不断地更新。

其中，交叉引物恒温扩增技术就是其中之一。

下面，将从实验原理、实验步骤、实验优缺点等几个方面来介绍这项技术。

一、实验原理交叉引物恒温扩增技术是利用核酸酶特异性修饰的基础上，引入两种简单补体（泛素和NEDD8）酶E1和酶E2、UbcH10和蛋白酶酶E后，在恒温条件下使两组特异性引物的3′端在一段距离的核酸序列上反向交叉形成一个中间部分，反转序列，交叉引物，形成环形序列。

整个反旋转操作在没有可识别序列的前提下自发完成。

然后，通过连续不停的自我扩增过程，在恒温的情况下进行，可以非常高效地产生大量的DNA片段。

具体细节可参见专业的实验指南。

二、实验步骤第一步：在实验过程中，首先需要准备好扩增试剂盒。

然后，按照试剂盒说明书的指示，准备好实验需要的生物样品和反应液体。

将反应液装入扩增管中，加入适当的DNA模板。

第二步：将扩增管号码标记好，并注明实验细节和样品编号。

将所有扩增管放置在扩增仪中，根据实验目的和需求，设置相应的扩增步骤和条件。

在保证实验质量的前提下，尽可能地进行扩增。

第三步：对于DNA产物的检测，可以使用琼脂糖凝胶电泳等方法进行实验。

通常，需要按注记在扩增管上的标签编号记录扩增产物的质量和产出量。

可以将扩增产物用PCR定量仪进行定量，但如果没有定量仪，则可以使用基础的测量方法进行计算。

三、实验优缺点该实验方法优点明显。

首先，实验过程简单易行，产生高效。

同时，该技术也可以用于快速分离固定目标序列和中间肿瘤基因“热点”突变基因，用于病原体基因检测和药品突变的分子生物学研究。

此外，交叉引物恒温扩增技术可以产生稳定的DNA序列，使得可扩增序列可以重复进行。

此外，该方法虽然放大的片段比较短，但可以对目标序列的特异性完美保证。

在实际使用中，交叉引物恒温扩增技术也存在一些缺陷。

首先，该方法需要充分了解DNA的基础知识，以做出正确的扩增结果。

.158-微F物与感染Journal of Microbes and Infctons#June25,2020,15(3)：158-165http：/i .cddoi：10.3969/j.issn.1673-6184.2020.03.004•论著・实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价黄晨璐1,许伟1,胡乾坤1,张小楠1,李强1,黄玉仙12,陈良11.复旦大学附属公共卫生临床中心，上海201508；2.复旦大学附属华山医院感染科，上海200040摘要:为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性，本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA(100IU/mL81例、HBV DNA V100IU/mL76例，以及作为对照的非HBV感染患者55例。

采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。

在HBV DNA(100IU/mL的CHB患者中，SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)*2种方法具有较好的相关性与一致性(R2=0.803和CCC=0.882)。

Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1log copies/mL,相对偏倚为0.97%。

配对t检验显示，结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。

在HBV DNA V100IU/mL的CHB患者血清样本中，HBV RNA阳性检出率不同，SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为8&16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R2=0.326和CCC=0.438)。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710250302.8(22)申请日 2017.04.17(71)申请人 河北农业大学地址 071000 河北省保定市灵雨寺街289号(72)发明人 张伟　马晓燕　檀建新　张先舟　杨倩　袁耀武　李英军　王志岩　张蕴哲　(74)专利代理机构 石家庄科诚专利事务所13113代理人 张红卫　贾彦虹(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对、试剂盒及其扩增方法(57)摘要本发明公开了一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及含有该引物对的试剂盒，该引物对设计合理，特异性强，应用于跨越式滚环核酸等温扩增时，能实现引物自身不扩增而目的基因扩增的效果；本发明还提供了跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，它包括提取模板、扩增、检测步骤，在扩增过程中实现目的DNA扩增而引物自身不扩增的结果，该方法简单，过程易于控制，步骤简单，耗时短，成本低。

本发明适用于对目的DNA进行扩增。

权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 106868192 A 2017.06.20C N 106868192A1.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，所述上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，所述上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45-55%，Tm值为55-58℃。

2.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物对的试剂盒。

3.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序依次进行：（1）从样品中提取DNA为模板；（2）利用权利要求1的引物对或者权利要求2的试剂盒中引物对作为扩增的引物，进行SRCA扩增，得到扩增产物；（3）检测扩增产物，做出判断。

人线粒体DNA(mtDNA)核酸检测试剂盒说明书【名称】通用名：人线粒体DNA(mtDNA)核酸扩增检测试剂盒英文名：Human Mitochontriol DNA Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction(PCR)Diagnostic kit汉语拼音：ren xian li ti DNA he suan kuo zeng jian ce shi ji he【目的】本试剂盒适用于检测人外周血、精液或组织等样本中线粒体DNA，用于生殖、胃肠功能紊乱以及遗传性相关疾病如男性不孕等疾病的辅助诊断以及药物疗效观察。

其检测结果仅供临床参考。

【原理】本试剂盒选取一对线粒体DNA(mtDNA)特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取DNA，后者在耐热DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针法提取扩增法对线进行扩增，从而达到快速实时定量检测线粒体DNA(mtDNA)之目的。

【组成】名称数量规格核酸提取液B4管500μl/管Taq酶系1管80μl/管mtDNA–PCR MIX1管960μl/管mtDNA阳性质控品1管50μl/管(1×107Copies/ml)阴性质控品1管500μl/管备注：红细胞裂解液(10×RCLB)等另行配备。

【标本采集、保存和运输】1.全血：用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入无菌2ml EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。

2.精液：无菌条件下取精液1-3ml，转至5ml洁净的离心管中，密闭送检。

3．组织：无菌条件下取待检组织0.1-0.5g，转至1.5ml洁净的离心管中，密闭送检。

3.保存和运输：标本可立即用于测试，2-8℃保存下不应超过24小时；-70℃以下长期保存。

避免反复冻融。

酶切探针恒温扩增法
接下来，让我们谈谈恒温扩增法。

恒温扩增法是一种在恒定温
度下进行的DNA扩增技术。

与传统的PCR技术不同，恒温扩增法不
需要周期性变化的温度。

这种方法通常使用一种特殊的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶，它能够在较高温度下活跃。

恒温扩增法通常结
合了等温环介导扩增（LAMP）或环介导扩增（RCA）等技术，以实现
快速、灵敏的DNA扩增。

将酶切探针和恒温扩增法结合起来，可以实现对特定DNA序列
的高度特异性检测。

通过将酶切探针与恒温扩增技术相结合，可以
在恒定温度下实现对特定基因的快速检测，而无需复杂的温度变化
步骤。

这种方法在临床诊断、环境监测和食品安全等领域具有潜在
的应用前景。

总的来说，酶切探针恒温扩增法结合了酶切探针技术和恒温扩
增技术的优势，能够实现对特定DNA序列的高度特异性检测，具有
快速、灵敏和简便的特点，有望在生物医学和生命科学领域发挥重
要作用。