中国动物检疫２００８年第２５卷第４期禽流感病毒（ＡＩＶ）属正粘病毒科，流感病毒属，其基因组是由８个分节段的单股负链ＲＮＡ组成，全长１３．６ｋｂ，编码１０个多肽，分别编码８个不同功能的蛋白。
ＮＳ基因编码ＮＳ１和ＮＳ２两种蛋白，根据ＮＳ基因序列的同源性将其分为Ａ和Ｂ两个等位基因群，群间的核甘酸的同源性约为７２．３％，群内的核甘酸的同源性为９０％以上。
禽源流感病毒非结构蛋白属于基因序列保守性比较高的Ｂ群［１，２］。
ＮＳ１蛋白编码２０２～２３７个氨基酸，分子量在２２～２６ＫＤ之间。
研究证实，ＮＳｌ非结构蛋白仅存在于病毒感染的细胞中，在病毒粒子中却检测不到。
在细胞感染早期，细胞核内的ＮＳ１蛋白被大量合成，且能诱导机体产生针对ＮＳ１蛋白的抗体［３］。
因此，可以通过检测抗ＮＳ１蛋白的抗体，来区分野毒感染和疫苗免疫，还可以作为早期感染的一个诊断指标。
本实验采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，克隆一株Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ的ＮＳ１基因，并将其重组到ｐＥＴ－３２ａ表达载体中，在大肠杆菌中诱导表达，为以后建立一种区分ＡＩＶ野毒感染和疫苗免疫的ＥＬＩＳＡ诊断方法及试剂盒的制备奠定基础。
１材料与方法１．１病毒和血清ＡＩＶ毒株由本实验室分离并移交国家禽流感参考实验室鉴定；Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ阳性血清和阴性血清由国家禽流感参考实验室惠赠。
１．２载体和菌株ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ｐＥＴ－３２ａ、大肠杆菌ＤＨ５α、ＢＬ２１均由本实验室保存。
１．３主要试剂和工具酶ＴｒｉｚｏｌＬＳＲｅｇｅｎｔ购自Ｉｎｔｒｉｖｉｇｅｎ公司；ＡＭＶ反转录酶、ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｔ４连接酶、ＤＬ－２０００Ｍａｒｋｅｒ及限制性内切酶ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ均购自Ｔａｋａｒａ公司；辣根过氧化物酶标二抗购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＵＮＩＱ－１０ＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司。
１．４ＲＴ－ＰＣＲ１．４．１引物合成：参照ＧｅｎＢａｎｋ中发表的ＡＩＶＨ５Ｎ１亚型的ＮＳ１基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计并合成了三条特异性引物Ｐ、Ｐ１、Ｐ２（Ｐ为反转录引物；Ｐ１、Ｐ２分别引入ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点）。
引物由上海生物工程有限公司合成。
引物序列如下（斜体表示引入的限制性酶切位点ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ）：Ｐ－５′ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ－３′Ｐ１－５′ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＣＣ－３′Ｐ２－５′ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣ－３′１．４．２ＲＮＡ抽提：按照ＴｒｉｚｏｌＬＳＲｅｇｅｎｔ说明书提取病毒基因组总ＲＮＡ。
１．４．３ｃＤＮＡ合成：取抽提的ＡＩＶ总ＲＮＡ５．５μＬ，加入１．５μＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）反转录引物Ｐ，８μｌｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、０．５μｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）、０．５μｌＡＭＶ反转录酶（５Ｕ／μｌ）、４μｌ５×ＡＭＶＢｕｆｆｅｒ，４２℃水浴１．５ｈ，置－２０℃备用。
１．４．４ＰＣＲ反应：１０×Ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、ｄＮＴＰ２μｌ、上下游引物Ｐ１、Ｐ２各０．５μｌ、ｒＴａｑ０．２５μｌ（５Ｕ／μｌ）、ｃＤＮＡ２μｌ、加灭菌三蒸水１７．２５μｌ，总体积为２５μｌ。
反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性５０ｓ，５７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．５目的片段克隆ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳后，用ＵＮＩＱ－１０柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒回收目的片段，按照ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ载体说明书将目的片段克隆到ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ载体上，转化ＤＨ５α感受态细胞，涂板。
挑选白斑，接种于含氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床中培养１２ｈ，取菌液用碱裂解法小量提取质粒（命名为ｐＧＥＭＴ－ＮＳ１）用ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定后送上海生工测序。
１．６重组表达质粒构建及鉴定将ｐＧＥＭＴ－ＮＳ１和ｐＥＴ－３２ａ分＊通讯作者Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒ＮＳ１的克隆和原核表达袁凯１，２）张志２）＊张乐翠１）李晓成２）黄保续２）张燕霞２）（１，青岛农业大学山东青岛２６６０１９２，中国动物卫生与流行病学中心２６６０３２）摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了一株Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）的ＮＳ１基因，克隆到ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ载体上，经序列测定和分析正确后，将该基因插入到ｐＥＴ－３２ａ载体中构建原核表达载体ｐＥＴ－ＮＳ１，阳性重组质粒转化ＢＬ２１感受态细胞，用１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后获得了分子质量约为５１ｋｕ的ＮＳ１融合蛋白。
通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ发现ＮＳ１蛋白可与Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ单因子血清反应。
为建立Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ野毒株和疫苗株的特异性鉴别方法奠定了基础。
关键词：禽流感病毒；非结构蛋白；表达Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＮＳ１ｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｆｒｏｍＨ５Ｎ１ｓｕｂｔｙｐｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ（ＡＩＶ）．Ａｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－３２ａｖｅｃｔｏｒ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－ＮＳ１ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ．Ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆ５１ＫｕａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄａｎｄｔｅｓｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｒｅａｃｔｗｉｔｈｔｈｅＮＳ１ｓｅｒｕｍｏｆｔｈｅＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｓｏｕｎｄｂａｓｅｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｆｉｅｌｄＡＩＶｓｔｒａｉｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡＩＶ；Ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ本栏目主持人：胡藕祥ｈｕｏｘ＠ｅｐｉｚｏｏ．ｏｒｇ文章编号：１００５－９４４Ｘ（２００８）０４－００１８－０２ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＰｒｏｃａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＳ１ＰｒｏｔｅｉｎｏｆＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓＨ５Ｎ１Ｓｕｂｔｙｐｅ试验研究－１８－中国动物检疫２００８年第２５卷第４期别用ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切，回收目的片段，用Ｔ４连接酶按适当的比例进行连接。
连接产物转化入ＢＬ２１感受态细胞，涂板。
挑选单菌落，接种于含氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床中培养１２ｈ，取菌液用碱裂解法小量提取质粒，经ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定后送上海生工测序。
１．７诱导表达经鉴定阳性重组质粒转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态，涂板挑菌，阳性菌在含氨苄青霉素的ＬＢ培养基中振摇培养过夜后，１：１００转接种含氨苄青霉素的２×ＹＴ培养基，３７℃振摇培养至对数生长期（ＯＤ６００＝０．６），加入终浓度为１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，在３７℃振摇诱导培养１～５ｈ。
１．８ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分别于诱导前和诱导后不同时间（１ｈ，２ｈ，３ｈ，４ｈ，５ｈ）收集上述诱导表达的菌体，经０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤后，用适量ＰＢＳ悬浮沉淀物，加入２倍ＳＤＳ裂解缓冲液，沸水煮５ｍｉｎ，按常规方法用１２％聚丙烯酰胺凝胶进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。
参照分子克隆实验指南［４］进行电转印，然后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ免疫印迹检测。
２结果与分析２．１目的基因片段扩增经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出的ＮＳ１基因片段大小约６９３ｂｐ，与预期目的基因片段大小相符（见图１）。
２．２重组测序载体质粒ＰＧＥＭＴ－ＮＳ１的鉴定将上述ＮＳ１基因片段克隆到ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ载体中，获得的重组质粒（ｐＧＥＭＴ－ＮＳ１）经ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切，出现了约６９３ｂｐ的目的片段，说明目的基因已正确插入，测序结果证实该基因序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ中发表的ＮＳ１基因序列一致，推测重组质粒读码框正确。
２．３重组表达载体质粒ｐＧＥＭＴ－ＮＳ１筛选与鉴定ｐＧＥＭＴ－ＮＳ１质粒经ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切，酶切下的基因片段克隆到同时双酶切过的表达载体ｐＥＴ－３２ａ中，获得了重组质粒ｐＥＴ－ＮＳ１，再经ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定，电泳结果显示酶切片段的大小与预期片段大小一致（见图２），说明得到阳性重组表达质粒。
２．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ用１２％聚丙烯酰胺凝胶对诱导前和不同浓度诱导后的样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，结果表明，ｐＥＴ－ＮＳ１／ＢＬ２１在诱导后出现一条大小约为５１ｋｕ的蛋白条带，与预期大小基本一致，而ｐＥＴ－３２ａ的空白载体诱导的阴性细菌则没有出现该条带。
由电泳结果可以看出，诱导３～５ｈ蛋白表达量明显增加（见图３）。
用ＡＩＶ阳性血清对重组菌诱导菌进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测。
结果显示表达产物在大小约５１ｋｕ处出现一清晰的特异性反应条带（见图４），表明重组蛋白可被ＡＩＶ阳性血清所识别。
３讨论禽流感的预防、控制和消灭，已做了大量的研究和探索，国外以前主要以淘汰和扑杀发病禽群为主，但是面对禽流感越来越严峻的形势，国外有些国家也开始采用疫苗免疫的方法来预防禽流感的发生。
我国一直采用更符合我国国情的措施，即疫苗免疫和扑杀相结合。
但是因为在免疫过程中各个环节存在不同的问题，虽然能在一定程度上降低死亡率，但不能完全抗感染，导致免疫禽群仍可发病。
另外，由于疫苗广泛使用，给区分野毒感染和疫苗免疫的禽群带来困难，不仅干扰禽流感的正常诊断，还增加了禽流感预防与控制的难度。
因此，结合分子生物学技术，建立实用、敏感的鉴别诊断方法已成为当务之急。
本试验利用融合表达载体成功诱导表达出了禽流感Ｈ５Ｎ１亚型的ＮＳ１蛋白，经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定显示：表达的ＮＳ１融合蛋白与感染Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ阳性血清具有反应原性。
ＮＳ１蛋白的成功表达，不仅为建立敏感、特异、区分灭活苗免疫和野毒感染的鉴别诊断方法奠定了基础，也为进一步研究ＮＳｌ蛋白的功能、单克隆抗体制备提供了基础，为以后禽流感工作的预防和监测奠定了基础。
参考文献［１］王传彬，孙明，赵铁柱，等．Ｈ９Ｎ２禽流感病毒分离株ＮＳ基因同源性分析［Ｊ］．中国预防兽医学报．２００４，２６（３）：１７７－１８０．［２］ＫａｗａｏｋａＹ，ＧｏｒｍａｎＯＴ，ＩｔｏＴ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｈｏｓｔｓｐｅｃｉｅｓｏｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ（ＮＳ）ｇｅｎｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＶｉｒｕｓＲｅｓ，１９９８，５５（２）：１４３－１５６．［３］ＳｋｅｈｅｌＪＪ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７２，４９（１）：２３－３６．［４］Ｊ．萨姆布鲁克，Ｅ．Ｆ．弗里奇，Ｔ．曼尼阿蒂斯著．分子克隆实验指南［Ｍ］．金冬雁等译，第２版，北京：科学出版社，１９９３．试验研究－１９－。
