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大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。
本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。
一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。
在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。
1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。
缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。
2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。
该方法已被最可能数(MPN)法所替代。
3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。
在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。
三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。
一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。
2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。
例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。
3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。
⾷品中⼤肠菌群的测定含MPN检索表实验六⾷品中⼤肠菌群的测定⼀、概述(⼀)⼤肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的⾷品卫⽣检验⽅法微⽣物学部分，⼤肠菌群(coliform bacteria)系指⼀群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产⽓，需氧和兼性厌氧的⾰兰⽒阴性⽆芽胞杆菌。
⼤肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的⼀些细菌所组成，即艾希⽒菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯⽒菌属及肠杆菌属，其⽣化特性分类见表5-4。
表5-4 ⼤肠菌群⽣化特性分类表注：+，表⽰阳性；—，表⽰阴性；+/-，表⽰多数阳性，少数阴性。
由上表可以看出，⼤肠菌群中⼤肠艾希⽒菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利⽤四个⽣化反应分别为“⼗⼗⼀⼀”，通常称为典型⼤肠杆菌；⽽其他类⼤肠杆菌则披称为⾮典型⼤肠杆菌。
(⼆)⼤肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)⽒⾸先提出⼤肠杆菌作为⽔源中病原菌污染的指标菌的意见，因为⼤肠杆菌是存在于⼈和动物的肠道内的常见细菌。
⼀年后，塞乌博⽿德“斯密斯(Theobold．Smith)⽒指出，⼤肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于⼈或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应⽤⼤肠杆菌作为⽔源中粪便污染的指标菌。
据研究发现，成⼈粪便中的⼤肠菌群的含量为：108个／g⼀109个／g。
若⽔中或⾷品中发现有⼤肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有⼤肠菌群的⽔或⾷品供⾷⽤是不安全的。
所以⽬前为评定⾷品的卫⽣质量⽽进⾏检验时，也都采⽤⼤肠菌群或⼤肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。
当然，有粪便污染，不⼀定就有肠道病原菌存在，但即使⽆病原菌，只要被粪便污染的⽔或⾷品，也是不卫⽣的，不受⼈喜欢的。
2．粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下⼏个特性，才能起到⽐较正确的指标作⽤。
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
3检验原理3.1 MPN法MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
4.4 天平：感量0.1 g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
4.9 无菌培养皿：直径90 mm。
4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001上限下限0.10.010.001上限下限000<3.0——9.522021 4.542 001 3.00.159.6221288.794 010 3.00.1511222358.794 011 6.1 1.218230298.794 020 6.2 1.218231368.794 0309.4 3.63830023 4.694 100 3.60.1718301388.7110 1017.2 1.3183026417180 10211 3.638310439180 1107.4 1.3203117517200 11111 3.63831212037420 12011 3.64231316040420 12115 4.5423209318420 13016 4.54232115037420 2009.2 1.43832221040430 20114 3.642323********* 20220 4.542330********* 21015 3.742331460902000 21120 4.54233211001804100 212278.794333>1100420——注 1：本表采用 3 个稀释度【 0.1g(mL) 、 0.01g(mL)注 2：表内所列检样量如改用1g(mL) 、0.1g(mL) 和表内数字应相应提高10 倍，其余类推。
和 0.001g(mL)] ，每个稀释度接种0.01g(mL) 时，表内数字应相应降低3 管。
10 倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.0001g(mL)时，则一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：ａ）样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；ｂ）采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；ｃ）微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
大肠菌群计数是一种估计悬浮在水溶液中活菌数的方法。
一般分几组进行，每一组各有数重复，分别以渐次的方式加入不同量的待测水溶液于培养液中进行培养，随后观察每一组中的试管是否有菌生长，然后再利用统计表估计菌数。
例如水中coliform数的测定，将待测水溶液以10ml,1ml及0.1ml的量分别加入各组，每组三重复，经培养后观察coliform是否有生长，统计有菌生长的管数，以统计表统计菌数。
活菌的浓度可利用MPN的方式来估计，方式简单，可分为下列两步骤：在培养基中作数个重复稀释；记录有菌生长的试管。
若试管中无生长，则可能代表连一支菌都没有生长。
从统计观点，MPN这个方法是一种非常没效率的方式，因为每一试管与培养皿表面生长的菌数只有很小部分符合。
然而MPN的好处有以下：若菌无法长在固态培养基时，便可使用；若菌的生长的动力学具有很大变化，便可使用：假设某些菌会会立即且迅速的生长，且会在固态培养基产生很大的菌落，且与我们要的菌落接触到或盖过时；因为较少且具高度游动性或快速生长的菌，可能形成小菌落，因而其数量是很多而导致无法计数；假如非我们所要菌存在，或无筛选的方法存在时，便可使用。
虽然有污染的细菌可以大量生长，但仍可藉由我们所要看的菌产生特定的产物来估计；假如琼脂或其他固化材料有某些因素会干扰我们计数时，便可使用大肠菌群MPN表3 3 1 460 71 2,4003 3 2 1,100 150 4,8003 3 3 > 1,100 > 150 > 4,800说明：若稀释倍数为10，100，1000倍（即每ml LST中0.1，0.01，0.001 ml（g）之检体），且LST均产气（正反应试管数3-3-3），经接种至EC，而其产气试管数为3-1-0，对照MPN为43，即为该检体大肠杆菌MPN数为43/ml（g）。
若稀释倍数为原液，10，100倍(即每ml LST中含1，0.1，0.01ml之检体而EC接种之正反应试管数亦为3-1-0，则该检体大肠杆菌MPN数为43÷10=4.3/ml。
大肠菌群计数
是一种估计悬浮在水溶液中活菌数的方法。
一般分几组进行，每一组各有数重复，分别以渐次的方式加入不同量的待测水溶液于培养液中进行培养，随后观察每一组中的试管是否有菌生长，然后再利用统计表估计菌数。
例如水中coliform数的测定，将待测水溶液以10ml,1ml 及 0.1ml 的量分别加入各组，每组三重复，经培养后观察 coliform 是否有生长，统计有菌生长的管数，以统计表统计菌数。
活菌的浓度可利用 MPN 的方式来估计，方式简单，可分为下列两步骤：
在培养基中作数个重复稀释；
记录有菌生长的试管。
若试管中无生长，则可能代表连一支菌都没有生长。
从统计观点， MPN 这个方法是一种非常没效率的方式，因为每一试管与培养皿表面生长的菌数只有很小部分符合。
然而 MPN 的好处有以下：
若菌无法长在固态培养基时，便可使用；
若菌的生长的动力学具有很大变化，便可使用：假设某些菌会会立即且迅速的生长，且会在固态培养基产生很大的菌落，且与我们要
的菌落接触到或盖过时；因为较少且具高度游动性或快速生长的菌，可能形成小菌落，因而其数量是很多而导致无法计数；
假如非我们所要菌存在，或无筛选的方法存在时，便可使用。
虽然有污染的细菌可以大量生长，但仍可藉由我们所要看的菌产生特定的产物来估计；
假如琼脂或其他固化材料有某些因素会干扰我们计数时，便可使用
大肠菌群MPN表
正反应试管数MPN/ml （ g ）95% 信赖界线
0.1ml0.01ml0.001ml下限上限
000< 3
0013< 59
0103< 513
020---
1004< 520
1017121
1107123
11111336
12011336
333> 1,100> 150> 4,800
说明：
若稀释倍数为 10 ， 100 ， 1000 倍（即每 ml LST 中 0.1 ，0.01 ， 0.001 ml （ g ）之检体），且 LST 均产气（正反应试管数3-3-3 ），经接种至 EC ，而其产气试管数为3-1-0 ，对照 MPN 为43 ，即为该检体大肠杆菌 MPN 数为 43/ml （ g ）。
若稀释倍数为原液， 10 ， 100 倍 ( 即每 ml LST 中含 1 ，0.1 ， 0.01ml 之检体而 EC 接种之正反应试管数亦为 3-1-0 ，则该检体大肠杆菌 MPN 数为43 ÷ 10=4. 3/ml 。
若稀释倍数为 100 ， 1000 ， 10000 倍时，结果同上，则该检体大肠杆菌 MPN 数为43×10=430/ml ，其余类推。
计算公式：×中间试管之稀释倍数＝ MPN ／ g （ ml ）
平板计数法：采用常规涂布平板法，37℃24h后计数。
培养基为营养琼指和伊红美兰琼脂。
多管发酵法：采用五管法，培养剂为液体EC培养基。
细菌总数：采用AODC法，具体操作按徐怀恕方法进行。
活菌直接计数：采用Kogure等方法：向水样加入0.002%萘啶酮酸和
0.025%酵母膏，在37℃下培养6-24h，加入甲醛（最终浓度为2%）固定，再按AODC法镜检计数。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。
