中文操作手册 phosflow 小鼠脾细胞 胸腺细胞-9

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西　于正强　胡东　李林蔚　(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。

外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。

免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。

红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。

是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。

2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。

用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。

3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。

吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。

然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。

弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。

小鼠脾细胞的制备实验报告摘要：
本实验旨在制备小鼠脾细胞，以便进行细胞培养。

通过酶解法和筛选法，成功地制备出了小鼠脾细胞，并进行了初步的鉴定。

材料和方法：
材料：小鼠脾脏，胰蛋白酶，DNA酶，PBS缓冲液，10% FBS 培养液。

方法：
1. 将小鼠用无菌手术刀杀死，取出脾脏，置于PBS缓冲液中。

2. 用无菌手术刀将脾脏切成小块，压碎后加入胰蛋白酶和DNA酶的混合液中，37℃水浴1h。

3. 过筛除去组织团块，收集过滤液。

4. 添加PBS缓冲液，离心定居细胞。

5. 吸上一定数量的10% FBS培养液，放入培养皿中，放入恒温培养箱中，37℃、5% CO2培养。

结果：
经过培养，小鼠脾细胞成功地进行了增殖。

细胞表现出了明显的亲和性，形态也比较正常。

经检测，成功制得小鼠脾细胞。

结论：
通过酶解法和筛选法，本实验成功地制备出了小鼠脾细胞。

它们可以进行细胞培养，被用于后续实验研究中。

小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。

实验前准备工作：做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；实验步骤：1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。

2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。

3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。

4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。

CFSE染色开始：5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。

取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。

6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。

小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。

步骤：1.烘烤。

用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。

烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。

2.割尾。

烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。

3.止血。

用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。

要点1.烤：烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。

烤的太过：小鼠死亡。

2.割：割的太浅：血液不流出。

割的太深：鼠尾被割断。

后续应用：取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。

所取血可用于血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。

附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血小鼠脾淋巴细胞分离所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm 中皿及血球计数板一块。

所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。

分离原理示意图图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图分离步骤及要点：1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。

2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。

换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。

脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。

取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。

注意无菌操作。

3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。

外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。

免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。

红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。

是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。

2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。

●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。

3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。

●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。

然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。

●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。

实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。

外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。

免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。

红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。

是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。

2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。

●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。

3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。

●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。

然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。

●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。

实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。

实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。

其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。

二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。

包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。

在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。

（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。

（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。

老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。

2)转动旋钮，调整量取体积。

顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。

小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。

1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。

流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。

通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。

1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。

在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。

1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。

通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。

同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。

2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。

小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。

小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。

2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。

小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。

我试过好多种方法，走了不少弯路呢。

我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。

先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。

然后取脾的时候，我就出过岔子。

有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。

我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。

取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。

我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。

经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。

制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。

有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。

刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。

对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。

但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。

后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。

而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。

这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。

还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。

后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。

比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。

大家一起讨论，把实验做得更好。

无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。

小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。

在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。

一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。

三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。

准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。

脾脏走行向与肋骨方向近似平行五，用镊子轻轻提起脾脏。

脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。

六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS（混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。

本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。

然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。

研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。

八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。

十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；至此，脾脏细胞就算提取完成了。

小鼠免疫组织及免疫细胞的观察【实验原理】免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。

中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。

各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。

【试剂和器材】小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛【操作方法】1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。

2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。

3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。

【结果观察】小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察【注意事项】1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。

2.脾脏分离完整，清研轻柔。

3.染色时间不宜过长或过短。

.【讨论】脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。

1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～2.4 %。

虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。

脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。

同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。

小鼠脾细胞悬液制备
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备:
1．小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上；
2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3．在脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目)上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎,加入400 u/ml 胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。

6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。

7、试取胸腺
注：一般6—8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。

2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械,在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌,此法较为简便。

小鼠脾脏细胞悬液制备流程
1. 脱颈处死小鼠，腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。

2. 75％乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。

3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer（FALCON，352350）并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。

4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。

5. 弃掉cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌15 ml离心管中，于4℃ 400g，离心5 min。

注：一旦取出脾脏，请置于冰上操作。

6. 将第5步离心后弃上清的脾脏细胞用5 ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解
5 min。

注：ACK裂解液配方如下表，配好之后用0.22 μm的滤膜过滤，4℃保存不超过1月
配制 500 ml 1´ACK buffer
NH₄Cl 4.1 g
KHCO30.5 g
0.5 M EDTA-2Na100 ml
7. 裂解结束后加入10 ml无菌PBS终止裂解反应，于4℃ 400g离心5 min。

8. 弃上清，用10 ml无菌PBS洗一次，弃上清后直接加入培养基重悬计数，一只脾脏可得3-10
´107个细胞。

注：如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作，请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。

免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取一、实验目的1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。

2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。

二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。

它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。

一般来讲，脾脏有三大功能：首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量；其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉；此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。

脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。

脾脏还有产生淋巴细胞的功能。

我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。

小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。

三、实验器材KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。

2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS冲洗，制得脾细胞悬液。

3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。

4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。

5、2000r/min离心30min。

6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。