维生素B2含量的测定一、实验目的：学习分子荧光产生的原理；利用荧光分光光度计绘制荧光激发与发射光谱图；学会判断谱图中各种峰的类型的方法。
二、实验原理：分子吸收短波长（高能量）的光后，能量释放以光的形式出现，而发射较激发光波长更长的荧光。
三、实验内容：1.维生素B2荧光激发光谱与发射光谱的绘制；打开软件并打开Edit窗口，根据实验目的设置测定参数。
例如：绘制发射光谱，设定激发波长为377nm（或者454nm），发射波长范围400～700nm。
绘制激发光谱可设定发射波长为527nm，激发波长范围为200～500nm。
根据图形，确定激发光谱和发射光谱荧光峰的位置。
2.维生素B2系列标准溶液的配制；分别取0.1000g/L标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0ml定量转移至25ml 容量瓶中，用去离子水稀释至25ml。
3.在选定激发波长（λ1）下测量系列标准溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长（λ2）下的荧光强度并绘制标准工作曲线；4.维生素B2片的处理：取维生素B2片（约0.065g）一片，用玻璃棒捣碎后定量转移至250ml容量瓶中，然后取5.00ml溶液稀释至25.00ml，在选定激发波长（λ1）下测量待测溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长下（λ2）的荧光强度并计算维生素B2的浓度（g/L）；5.根据以上数据，求出维生素B2的含量（以百分比浓度表示x％）。
四、注意事项：1.绘制标准工作曲线与待测溶液所选定的波长λ1/λ2应一致；2.能正确识别荧光光谱中的干扰峰（拉曼光等）五、思考题1. 为何荧光分析的灵敏度通常比紫外可见吸收光谱的灵敏度高2～4个数量级？2. 具有哪些结构的分子通常具有较高的荧光量子产率？。
实验三荧光分析法测定尿中核黄素（VB2）含量【目的要求】1.掌握荧光分析法的基本原理及方法。
2.掌握固相萃取法对样品进行分离纯化的技术。
3.熟悉荧光分光光度计的使用方法。
【原理】核黄素（VB2）在一定波长的光波照射下发荧光。
在pH6~7的溶液中荧光最强，在其它条件恒定时，荧光强度F与VB2浓度C成正比，即F=K C；当pH>11时荧光消失。
尿中共存物质干扰VB2的测定，需将尿液通过硅镁吸附柱，使其中VB2被硅镁吸附剂吸附，再用洗脱液洗脱，测定洗脱液中VB2的荧光强度。
采用标准曲线法进行定量。
【仪器和材料】1．仪器与器皿荧光分光光度计，样品池，脱脂棉，吸附柱（内径0.8～1.0cm，柱长8cm），50ml、1000ml容量瓶，10ml比色管，2ml移液管。
2．试剂（1）VB2标准贮备液（25mg/L）：准确称取25.0mg核黄素，加400ml超纯水，加冰醋酸1～2ml，加热溶解，冷却后转移至1000ml容量瓶中并用超纯水稀释定容，摇匀，贮存于棕色试剂瓶中。
（2）VB2标准应用液（0.5 g/ml）：取标准贮备液1ml于50ml棕色容量瓶中，用0.1mol/LHAc溶液稀释至刻度，摇匀（现用现配）。
（3）硅镁吸附剂（60～100目）。
（4）洗脱液：按体积比丙酮：冰醋酸：双蒸水＝5：2：9。
（5）0.1mol/L HAc溶液。
【操作步骤】1.装柱用一小团脱脂棉将吸附柱管下端轻轻塞住，将1.5g左右的硅镁吸附剂于适量的蒸馏水混合装柱（约占柱长的2/3左右），用双蒸水测试流速，流速控制在60～80滴/分，柱内应无气泡。
2.标准曲线的绘制（1）吸附：取VB 2标准应用液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50ml ，分别过柱，用15～20ml 热水（60～70℃）淋洗柱子。
（2）洗脱：将10ml 比色管接在柱子下端，每个吸附柱中加入5ml 洗脱液，待流尽后再用不足5ml 的蒸馏水淋洗柱子，流出液一并盛入比色管中，用双蒸水定容至10ml ，混匀，避光保存。
实验项目：荧光分光光度法测定维生素B2的含量【实验题目】荧光分光光度法测定维生素B2的含量【实验目的】1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
【实验原理】维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。
其结构式为：由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。
维生素B2在pH＝6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F＝2.303ФI0εbc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc这是荧光光语法定量分析的依据。
【主要仪器与试剂】主要仪器：F-2500 HiTachi荧光分光光度计；1cm石英皿；50mL容量瓶；5mL移液管；烧杯；胶头滴管试剂：维生素B2标准溶液：未知液 4【实验内容及步骤】1、系列标准溶液的制备取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
标记为①②③④⑤的一系列维生素B2标准溶液。
待测。
2、待测液制备取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
待测。
3、激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置λem＝540nm为发射波长，在250~500nm范围内扫描标准溶液③，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。
实验五 荧光光度法测定维生素B 2的含量一、实验目的1、学习荧光分光光度法测定维生素B 2的分析原理；2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B 2的方法。
二、实验原理1.荧光光度法原理（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c 有以下的关系：bc I I F εφ0303.2=当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：Kc I F =这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
（2）荧光分析法的特点：a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。
b. 选择性好。
荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c. 所需试样量少、操作方法简便。
（3）荧光光谱激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。
激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
（4）荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量维生素B 2（又叫核黄素，VB 2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：H HO HO HO HNH H HOHNC NHNOOH 3CH 3C维生素B 2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B 2溶液在430～440 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm 。
