黑胶虫作业
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为害杨梅的油茶黑胶粉虱近期,许多果农反映杨梅叶背面有很多黑点状的虫,此虫乃是油茶黑胶粉虱,又叫槠黑粉虱、槠黑漆粉虱、小黑粉虱。
原危害普通油茶,并引发煤污病,近两年在杨梅树上也普遍发生为害。
油茶黑胶粉虱以口针插入叶片组织取食,绝大多数幼虫寄生于叶片背面,枝、干、花、果等部位很少见。
该虫一年发生1代,以2龄以上幼虫于黑色蛹壳下在叶背越冬。
次年3月下旬化蛹,4月上旬开始羽化,4月中旬为羽化盛期,大多在上午8~10时开始羽化,12时至下午2时为羽化高峰。
成虫羽化延续20天左右,而羽化高峰期仅几天。
成虫有多次交尾现象,交尾后即可产卵,时晴时雨天气最适宜羽化产卵。
卵大多产于新、老叶片背面,每头雌虫可产卵30余粒,产卵后的雌成虫转移到新梢嫩叶上栖息,寿命仅4~5天。
幼虫于6月上、中旬出现,善于爬行,找到合适部位后用口针刺入叶片取食。
7月中、下旬普遍脱皮进入2龄,2龄幼虫的足、触角退化,丧失活动能力。
虫体背腹扁平,并形成黑色介壳,然后分泌出无色透明粘胶固着虫体,以后就在介壳下发育至3龄,直至化蛹,而不再迁移转位,这就是所见的黑点虫体。
因为2龄幼虫历期长达250天左右,故危害性大,既直接为害杨梅叶片,又能诱发煤污病,影响树体生长,造成落花落果。
防治方法:①该虫喜阴湿环境,多发生在郁闭度大的叶片上,从2龄幼虫到成虫这阶段营定位生活,故可通过剪除病虫枝叶,降低虫口密度,并增加通风透光度,减轻和抑制为害。
②待杨梅采收后及时喷药。
可供选用的药剂有:40%速扑杀(杀扑磷)乳油1500~2000倍液;48%乐斯本乳油1000~1200倍液;80%敌敌畏乳油1000倍液;25%扑虱灵乳油1500倍液;50%马拉松乳油1000倍液或25%亚胺硫磷乳油1500倍液等。
每隔15天喷1次,连喷2~3次。
黑胶虫污染细胞的表现
黑胶虫可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液不浑浊,一般不会太影响,细胞还是可以用的。
污染现象:常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
处理办法:数量不多的时候对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。
使用“黑胶虫”清除培养基3天之后即可见清除效果,连续使用12到14天即可将“黑胶虫”清除,若“黑胶虫”污染较为严重,可延长处理3到5天。
换好一点的血清,当然最好是进口胎牛血清(国产血清太脏),就是价格高的离谱,经济条件不允许,可以用进口新生牛血清代替。
建议如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必灭活,这样可以有效减少“小黑点”的形成。
一般的血清都不要去灭活处理,为什么呢?INVITROGEN公司在其血清说明书上解析道:经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。
经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。
而经过热灭活的血清,沉淀物的形成会显著增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
除非是在做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,才推荐做热灭活。
所以在不是做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞培养时,血清尽量不经热灭活。
2.如果是贴壁细胞的话,可用无菌的PBS洗几次,可一定程度上缓解。
若是悬浮的话,就不太好处理拉,可以向其中少加一点滋养细胞。
加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效!还有就是实验环境要注意好,保持细胞间整个环境的洁净度。
如果细胞不是非常珍贵,可以用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔,也有建议庆大霉素500ug/ml洗涤。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.停止复苏,停止养细胞,彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品,包括所用的培养瓶,培养基,吸管,胰酶,孵箱,超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。
一个星期后,再复苏污染之前冻存的细胞,注意你的白大衣衣袖污染即可。
这样你可能觉得动作太大,但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间,还有其他你为了找到污染源,去除污染所耗费的精力,和财力。
5.在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打,冲洗干净后再加入培养液,坚持天天洗,传代时加生理盐水再离心一次,接种密度稍大一些,一段时间后,虫子就会大大减少,对细胞的生长也不会有大的影响。
细胞培养中的黑胶虫污染问题的处理!(2015-07-30 13:32:36)转载▼我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞,细胞刚到的时候,观察均生长良好,密度适中,培养液清亮,也没有见小黑点,但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点,有时候在一夜之间暴长,给培养液加庆大霉素,也无济于事,对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少,但是随后几天又出现,刚开始怀疑操作有问题,但是由有经验的老师操作也出现这种问题,陆续对培养液,血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养,生长快,很快铺满,仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞,没有使用我们的血清,直接吸出多余的培养液后,进行培养,传代后用原来吸出的培养液进行培养,同样发现了问题。
黑焦虫的特点:1、与细胞共生,细胞长的好或密度大的话,小黑点就少,反之则多。
2、对抗生素无效。
3、可能通过培养箱空气进行污染。
4、单用培养液及血清培养没发现问题。
5、换掖冲洗后也无效。
以下是论坛里我找来的相关帖子内容。
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物,“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长,开始时对细胞并没有什么影响,但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候,细胞生长就会受到影响直至死亡,严重影响了科研活动的开展和进行。
所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断,尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物,增殖缓慢但对细胞有损害,数量达到一定程度可引起细胞死亡,其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。
该污染在全世界细胞实验室中普遍存在,解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论:1、玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西(曾经有文献报道过)。
黑胶虫1、黑胶虫概况:在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动(类似布朗运动),这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体(我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现),目前业内人士称其为“黑胶虫”。
黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑。
黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物。
如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡。
不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的:①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响。
②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”。
③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有很大关系。
2、目前对“黑胶虫”的定论:有2种解释:第一,黑胶虫为生物。
它是小于细菌的生物,直径小于0.1μm,大多国外血清中多见,可能是国外牛血清中含有的某种原虫。
只要它是生物,那么在培养基中一定会对细胞有影响。
第二,黑胶虫不是生物。
国内的血清中,通常灭活之后都会有絮状沉淀出现,而黑胶虫出现时,所使用的血清被反复冻融过多次。
所以推测,所谓的“黑胶虫”其实就是血清中的某些蛋白成分的物质,经过灭活之后丧失活性,在培养基中,镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动”。
随着细胞消耗培养基,这些物质越来越多,最后细胞所用的营养消耗完,细胞容易死亡。
3、对于“黑胶虫”的处理方法:首先,血清买回来灭活前冻融应逐级冻融,即按照-20℃——4℃完全融化后,再置入水浴中,与室温一起升高到56度,这样的目的是避免温度骤变,导致血清中的营养物质丧失活性。
第二,血清灭活后分装保存。
按照每次用血清的量分装,尽量减少血清冻融的次数。
分装时注意无菌。
第三,细胞培养时血清浓度稍大一些。
通常细胞培养血清浓度为10%-15%,但如果血清冻融次数过多,那营养物质丧失活性,按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分,故培养基配置时一般用18%-20%的血清。
黑虫养殖方法及注意事项摘要:黑虫是一种高蛋白、低脂肪的营养丰富的食品,近年来越来越多的人开始兴趣在家里养殖黑虫。
本文将介绍黑虫的养殖方法以及注意事项,帮助读者了解如何正确养殖黑虫。
正文:一、黑虫的养殖方法1. 环境搭建:黑虫对光线和温度有一定要求,最适宜的光照强度为2000勒克斯,温度在20℃-25℃之间。
因此,在养殖黑虫前,我们应将养殖场所进行合理的环境搭建,如控制光照强度和温度,确保黑虫有良好的生存条件。
2. 饲料选择:黑虫主要以腐烂的有机材料为食,如水果皮、蔬菜残渣等。
我们可以将食材进行粉碎,然后铺在黑虫的养殖箱里,以提供它们充足的食物。
3. 繁殖与收取:黑虫的寿命短,繁殖速度快。
通常情况下,我们可将一定数量的黑虫投放养殖箱内,经过相应时间的繁殖,虫蛹数量会迅速增加。
此时,我们可以取出虫蛹,供食或进行销售。
二、黑虫养殖过程中的注意事项1. 增加饲料种类和营养:黑虫的养殖过程中,我们可以适量增加饲料种类,以提供更多不同种类的营养,帮助黑虫健康成长。
同时也要注意营养的均衡,不可过多或不足。
2. 定期清理养殖环境:黑虫繁殖速度快,虫体庞大后,养殖环境容易变得拥挤,这样会对黑虫的生长产生不良影响。
因此,我们要定期清理养殖环境,给黑虫提供一个干净整洁的生活环境。
3. 防止病害和虫害的侵扰:黑虫养殖过程中,常常会遭受各种病害和虫害的侵袭,如霉菌、蛇蝎等。
为了保护黑虫的平安生长,我们应及时对养殖环境进行消毒和防虫处理,减少病害的发生。
4. 水分管理:黑虫适宜生长的水分是相对较高的,但过多的水分会导致黑虫生长不良。
因此,在养殖过程中,要掌握好合适的水分管理,避免给黑虫带来不利影响。
总结:通过本文的介绍,我们可以了解到黑虫的养殖方法以及需要注意的事项。
在实际养殖过程中,需要我们合理搭建环境,选择适当的饲料,定期清理养殖环境,防止病害侵袭,并掌握好水分管理等。
只有正确进行黑虫的养殖,才能保证黑虫的健康生长,获取更好的经济效益。
黑壳虫养殖方法和注意事项摘要:黑壳虫是一种受欢迎的养殖昆虫,其幼虫具有较高的蛋白质含量,且生长迅速,适合作为饲料或肉食性宠物。
本文将介绍黑壳虫的养殖方法和注意事项,包括养殖环境、饲料选择、繁殖方式和疾病防治等方面的内容。
正文:引言:黑壳虫(也称黑鞘虫)是一种小型的节肢动物,其广泛分布于世界各地的温暖地区。
由于黑壳虫的幼虫富含蛋白质并且易于养殖,近年来越来越多的人选择在家中或职业上养殖这种昆虫。
本文将介绍如何成功养殖黑壳虫并注意养殖过程中的一些重要事项。
一、养殖环境的准备养殖黑壳虫需要为其提供一个适宜的生长环境。
首先,选择一个通风良好、光照适宜的地方,避免暴晒和过于潮湿的环境。
其次,准备一个合适的养殖箱或容器,可使用透明的塑料盒子或玻璃坛子。
注意选择容器的大小,以便适应黑壳虫的生长和繁殖。
二、饲料的选择黑壳虫的饲料主要以有机废料为主,如腐烂的水果、蔬菜或粮食渣滓等。
在养殖过程中,需要经常更换新鲜的饲料,避免腐烂食物滋生细菌和霉菌。
此外,可以添加一些富含蛋白质的饲料,如鱼粉、虫粉或蛋白粉等,以提高黑壳虫的生长速度和养分含量。
三、繁殖和补充群体黑壳虫是以幼虫状态进行养殖,成虫的寿命较短不能长时间繁殖。
繁殖时,将幼虫放入携带有饲料的新容器中,以促进其成长和繁殖。
当幼虫体型达到一定大小后,可将其分散到多个容器,以避免过度竞争和饲料不足。
每隔一段时间,根据需求补充新的幼虫群体,以确保养殖进程的持续性。
四、疾病防治与卫生措施在养殖黑壳虫的过程中,应加强疾病防治与卫生措施,以保持养殖环境的清洁和虫群的健康。
首先,注意及时清理和更换食物残渣,避免滋生病菌和细菌。
其次,定期清洗养殖器具和容器,使用消毒液洗涤并充分晾干,以杀灭潜在的病原体。
如发现虫群有异常现象,应立即进行分离处理,并探索可能的疾病原因。
结论:黑壳虫养殖是一项相对容易且具有较高经济效益的活动。
通过提供适宜的养殖环境、选择合适的饲料、合理繁殖和加强卫生防治措施,可以顺利养殖出质优量足的黑壳虫。
黑胶虫污染
“黑胶虫”主要为支原体污染,部分为未知的增殖不明显的细菌污染。
“黑胶虫”污染常见表现:
1、培养液不浑浊,但在低倍镜下,“黑胶虫”呈黑色颗粒状或片状;在高倍镜下,黑色颗粒在原地进行“布朗运动”,并且“黑胶虫”与细胞数量呈负相关,且随着细培养时间的延长“小黑点”逐渐增多,更换培养液或洗涤细胞不能将其去除;
2、“小黑点”污染的细胞,营养消耗快,需要频繁更换培养液;
3、“黑胶虫”污染的细胞生长缓慢,细胞状态差,空泡化严重,甚至还可能导致细胞形态的改变。
处理方法:
若细胞状态尚可,添加黑胶虫/支原体抑制剂培养2-3代即可转阴;若细胞状态很差,建议消杀后丢弃。
细胞培养中的黑胶虫问题1.我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞,细胞刚到的时候,观察均生长良好,密度适中,培养液清亮,也没有见小黑点,但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点,有时候在一夜之间暴长,给培养液加庆大霉素,也无济于事,对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少,但是随后几天又出现,刚开始怀疑操作有问题,但是由有经验的老师操作也出现这种问题,陆续对培养液,血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养,生长快,很快铺满,仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞,没有使用我们的血清,直接吸出多余的培养液后,进行培养,传代后用原来吸出的培养液进行培养,同样发现了问题。
可以发现如下的特点:(1)与细胞共生,细胞长的好或密度大的话,小黑点就少,反之则多;(2)对抗生素无效;(3)可能通过培养箱空气进行污染;(4)单用培养液及血清培养没发现问题。
(5)换掖冲洗后也无效。
以下是论坛里我找来的相关帖子内容“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物,“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长,开始时对细胞并没有什么影响,但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候,细胞生长就会受到影响直至死亡,严重影响了科研活动的开展和进行。
所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断,尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物,增殖缓慢但对细胞有损害,数量达到一定程度可引起细胞死亡,其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。
该污染在全世界细胞实验室中普遍存在,解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西(曾经有文献报道过)B. 据说这是黑胶虫,又有人说是原生动物,好象也没个统一的说法C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫,似乎和草履虫和变形虫有类似之处,然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
黑虫的养殖方法及注意事项摘要:黑虫(也称为深山瞪羚虫)是一种常见的养殖昆虫,其养殖方法相对简单,但也需要注意一些事项。
本文将介绍黑虫的养殖方法,包括饲养环境、饲料选择、适宜温度等。
此外,还会提到一些注意事项,如防治病虫害、定期清理和群体掉落等。
无论是初学者还是有一定经验的养殖者,都可以从本文中了解黑虫养殖的基本知识和技巧。
正文:黑虫是一种养殖较为普遍的昆虫,其具有较好的经济价值和市场需求。
在养殖黑虫时,首先需要确定养殖场所和养殖箱的选址。
一般来说,黑虫的养殖箱可选择塑料箱或木箱,具体材质无硬性限制。
然而,无论选择何种材质的养殖箱,都要确保其具备良好的透气性和保温性能,这对黑虫的生长发育非常重要。
养殖黑虫的环境温度也是关键因素之一。
需要特别注意的是,黑虫所处的环境温度不能过高或过低,一般适宜的温度范围为20°C-35°C。
在冬季寒冷的地区,可以使用加热设备或增加养殖房的保温措施,以保持适宜的温度。
在养殖黑虫时,饲料的选择也起到至关重要的作用。
黑虫主要以凡人类食用的植物和果实为食,包括红薯、橙子、苹果等。
养殖者应该选择优质、新鲜的植物和果实作为黑虫的主要饲料,以确保其长期健康发育。
除了提供合适的饲料和温度,养殖者还需要注意防治病虫害。
常见的黑虫病虫害有蚁螨、细菌感染和真菌感染等。
为了预防病虫害的产生,可以定期清洁养殖箱,并保持良好的通风,防止湿度过高。
此外,如果发现黑虫群体中出现异常情况,如运动迟缓或异常整体掉落,应及时处理并寻求兽医的帮助。
定期清理黑虫养殖环境也是养殖者需注意的一个方面。
养殖箱中可能会积累黑虫粪便等废物,如果不及时清理,可能会影响黑虫的健康状况和生长发育。
因此,每隔一段时间,养殖者应该将养殖箱进行清理,并用清水冲洗或更换新的储存材料。
总的来说,养殖黑虫是一项较为简单和有趣的事业。
只要有适宜的养殖环境、合理的饲料选择并重视病虫害防治,初学者和有一定经验的养殖者都能够成功地养殖出健康的黑虫。
黑菌虫用途黑菌虫(Entomophthora muscae)是一种寄生性真菌,主要寄生于家蝇(Musca domestica)等种类的昆虫身上。
它的寄生方式独特,会潜伏在昆虫体内,最终将昆虫杀死。
黑菌虫具有多种用途,下面将详细介绍以下几个方面:1. 生物防治黑菌虫是一种可以用于昆虫害虫防治的生物制剂。
在农业、园艺等领域中,昆虫害虫是对作物产量和品质造成严重威胁的因素之一。
传统的化学农药虽然可以有效控制害虫,但会对环境和生态系统造成不良影响。
而使用黑菌虫进行生物防治,可以减少农药的使用量,不会产生残留,对环境友好。
黑菌虫通过寄生害虫体内,利用害虫为食源,最终将害虫灭杀,从而防止害虫危害作物。
因此,黑菌虫在农业生产中具有广泛的应用前景。
2. 昆虫学研究黑菌虫作为一种寄生性真菌,对昆虫病理学研究具有重要意义。
它能够深入昆虫体内,寄生和感染害虫,研究黑菌虫的生态、生理学特性和寄生机制,可以帮助科学家更好地了解昆虫的生活史、寄生感染过程等昆虫学基础知识,为昆虫分类和昆虫害虫防治提供理论依据。
3. 药物研发黑菌虫寄生于昆虫体内,它所产生的一些代谢产物具有一定的药理活性。
这些活性物质可能对人类健康有益,并具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。
因此,科学家可以通过研究黑菌虫及其产物,开发出具有药物活性的化合物,为药物研发提供新的方向。
目前,已经有一些研究报道了黑菌虫产生的代谢产物对人类疾病的潜在治疗作用,如利用黑菌虫的次生代谢产物进行抗癌研究等。
4. 生物学教学黑菌虫也可以作为生物学教学中的实验材料。
由于黑菌虫在昆虫体内生长,会对昆虫造成病变,学生可以通过对黑菌虫和害虫的观察,了解寄生性真菌对宿主的影响和寄生生物学过程。
这不仅有助于学生对生物学的理解,还可以培养学生的科学研究兴趣和实验操作能力。
总结起来,黑菌虫作为一种寄生性真菌,具有多种用途。
它可以作为生物防治的生物制剂,减少对化学农药的依赖,保护农作物免受昆虫害虫的侵害。
消灭黑菌虫的方法
黑菌虫是一种危害农业和林业的生物害虫,可能会导致作物死亡、树木枯萎和土地退化。
以下是一些消灭黑菌虫的方法:
1. 化学防治:使用黑菌虫杀虫剂,如有机磷、氨基甲酸酯类、菊酯类等。
这些化学物质可以杀死黑菌虫及其卵、幼虫和成虫。
使用时需要按照说明书进行操作,注意保护环境和动物健康。
2. 物理防治:使用黑菌虫捕食器。
这些捕食器可以是粘板、捕虫笼、喷雾器等,可以通过吸引黑菌虫来捕捉它们,并将其消灭。
3. 生物防治:利用黑菌虫天敌来消灭黑菌虫。
例如,蜘蛛、蚂蚁、昆虫等可以捕捉黑菌虫。
将这些天敌放在田间或释放到森林中,可以有效地控制黑菌虫数量。
4. 农业措施:加强农业措施,如及时修剪、施肥、轮作、间作等,可以减少黑菌虫的发生和数量。
同时,合理使用农药和化肥,避免过度使用化学农药,也可以减少黑菌虫的发生。
消灭黑菌虫需要多种措施的综合应用。
在选择和使用杀虫剂、捕食器等防治措施时,需要注意保护环境和动物健康,避免对环境和动物造成二次危害。
在细胞培养中常可见到一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在细胞及培养液中做不规则运动。
镜下检查颗粒数目(100×),每视野计数在10个以上者就有可能使细胞生长受到影响。
若培养过程中,其数量继续增多则可能导致细胞停止增殖继而死亡。
人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。
近年来,黑胶虫在现代细胞培养中被广泛讨论,但大多数文献未对其进行描述或仅一带而过。
从各个实验中发现,黑胶虫在不同条件或不同种类细胞的培养时对细胞培养的影响大小不一,但存在以下几个特点:(1)黑胶虫与细胞竞争生长,使细胞状态恶化甚至死亡,但不引起培养液浑浊;(2)多数情况下,抗生素对黑胶虫无效;(3)一般单用培养液及血清培养不会得到黑胶虫;(4)黑胶虫在培养体系中多做典型的布朗运动。
科学家们至今尚未对黑胶虫进行分类学上的归类,但对其身份有多种猜测。
一.非生物
有部分科学家认为,任何一种外来生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现,而不是简单的运动。
如果黑胶虫的运动状况已达到用显微镜可观察到的程度,其营养代谢和能量需求也可想而知,那么,培养液中营养的消耗将加大、酸碱含量都将发生明显变化。
比如出现迅速、大含量的沉淀,pH值的迅速下降,细胞大量破碎死亡,引发其他微生物侵染等。
但这些状况在黑胶虫感染中很难观察到。
因此,有科学家提出黑胶虫为非生物。
(1)细胞碎片说
在从37℃环境中取出细胞进行观察时,由于液体培养基比热大,液内环境高于外界温度,造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧,即出现观察到的“虫体”游动。
同时随着细胞培养的继续,部分细胞开始衰亡,细胞膜结构破裂。
破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。
尤其是溶酶体的破坏,连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤,如果换液不很勤,又会出现进一步破坏和更多的残渣,即表现为“虫体”增多,同时细胞状态恶化甚至死亡。
(2)无机物说
在1990年发表于细胞生物学杂志上的《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》中,青岛医学院肿瘤研究室指出,细胞培养中的黑色运动颗粒为硅复合物。
该研究小组收集和实验了不同产地的小牛血清,以组织培养方式,通过能谱扫描电镜和电感耦合等离子发射光谱分析仪观察,用紫外分光及电泳透析进行生化分析。
他们发现用各种杀灭微生物的方法都杀不死黑色颗粒。
在光镜、透射和扫描电镜视野下,只能看到大小不等的颗粒,未见到细胞核、核膜、细胞器及绒毛等生物体结构。
将牛血清中收集的运动颗粒分别洗涤后匀浆,进行紫外分光光度计测定,未见蛋白质吸收峰。
能谱扫描电镜观察分析黑色颗粒是一种硅化合物,成分主要为硅,其次为钙和钾。
电感耦合等离子发射光谱分析结果表明黑色颗粒可能来自于培养液对玻璃器皿的侵蚀,部分来源于培养细胞本身。
(3)血清聚合物产物
有人对Gibco公司的血清进行研究后认为,黑色颗粒为血清聚合产物,是血清灭活之后出现的类似絮状沉淀。
二.生物
黑胶虫一般出现在血清培养中,有时在一夜之间暴长,加入了各种抗生素也无济于事,即便冲洗后减少,但几天后依旧出现。
这样反复的出现和活力让一些科学家认为黑胶虫是一种生物。
但血清是经过0.1μm滤膜过滤的,一般不存在细菌、霉菌或支原体。
基于这些考虑,科学家们对黑胶虫的身份有以下几个猜测。
(1)寄生性原虫
有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到黑胶虫有两种不同的形态,一种很大,运动较慢,泛红光,另一种较小,运动较快,红中带绿,个小的围着个大的分布,很可能是公的围着雌的。
在本研究中,也有人对无细胞的血清进行培养,并发现4周后视野内均为黑煤
渣般的黑胶虫。
而中国病毒所和军科院均鉴定黑胶虫是一种寄生与牛血清内的原虫,与草履虫有一定的相似,但研究课题经费不足,而未继续。
(2)纳米细菌
纳米细菌是一种细胞内存在的原核生物,能通过100nm滤菌器,属于革兰阴性菌,在高温、高酸等极端条件下仍能存活,不能用普通微生物培养液或支原体培养基培养,但能用细胞培养基培养,通常细菌染色方法难以着色。
但从另一方面看,纳米细菌在适宜的条件下可以在固体培养基中生长,并形成直径1mm大小的细菌集落,而黑胶虫无法单独培养之集落。
黑胶虫是否为纳米细菌还有待证实。
黑胶虫到底是否为生物?到底是何种生物?这些问题一种困扰着细胞培养者,但是科学家们依旧坚持不懈的寻找去除黑胶虫的方法,期望得到清洁、生长良好的细胞。
在去除黑胶虫方面,科学家们提出了下面几种解决措施:
(1)新洁尔灭(苯扎溴铵)处理
实验人员取有黑胶虫污染的六孔板,每孔内有2ml培养液,向污染孔内分别加入不同浓度的新洁尔灭原液,并在倒置显微镜下观察。
他们发现,加入新洁尔灭时,培养液内逐渐浑浊,并有絮状物质形成,此时可观察到黑胶虫逐渐停止运动。
但考虑到新洁尔灭有可能影响细胞的生长,该实验组认为,在对待并不十分珍贵的细胞时,可以尝试用新洁尔灭进行处理。
(2)选择优质血清
最好选择进口血清,但也有外国血清会出现黑胶虫。
当使用外国血清,特别是Hyclone 或Gibco的血清可不必灭活。
因为Invitrogen公司在其血清说明书上解析道:经过正确处理的热灭活血清,对大多数细胞而言是不需要的,却会形成很多的沉淀物。
在对血清的处理方面,应逐级冻融,按照-20℃~4℃完全融化后,再置入水浴中,与室温一起升高到56℃,以防温度骤变,导致血清中营养物质丧失活性。
同时将血清分装保存,减少冻融次数。
(3)换用进口一次性塑料培养瓶
(4)洗涤细胞
对于贴壁细胞,用无菌PBS洗涤几次,可在一定程度上缓解黑胶虫。
对于悬浮细胞,可向其中加入少量滋养细胞,如小鼠腹腔巨噬细胞以吞噬黑胶虫。
对于特别珍贵的细胞,可以将污染的细胞接种到免疫缺陷小鼠体内,一段时间后再取出重新克隆化。
如要换液,最好在换液前先加入生理盐水轻轻拍打,冲洗干净后再加入培养液,坚持天天洗涤,并在传代时加生理盐水再离心,加大接种密度。
(5)使用抗生素
根据药敏试验结果选择对细胞状态影响较小的抗生素。
有人推荐两种抗生素联用,但并未验证此方法有效性。
(6)注意操作
有时黑胶虫可能只是细胞培养过程中出现的细菌、真菌或支原体等的污染或是细胞状态不好时的细胞碎片,但实验者并未加以区分和确认,只是归咎于黑胶虫这一“不可抗力”。
也许只是担忧过甚,但依旧有人认为黑胶虫快成了科研中的迷信,是某些科学家轻易用一个不知道是什么的东西试图解释实验现象的一个借口。
真正该做好的是实验过程中对各个操作和材料的污染的控制。
就我们自己而言,在实验过程中,要加强自己的责任心,要细心稳重,操作技术要熟练。
进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。
进入后关好门,坐下来尽量少走动。
工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。
操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。
操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
操作时要常更换吸管,切勿一根吸
管做到底。
一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。
实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。
也要防止细胞交叉污染,如在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最好做上标记便于辨别。
并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。
在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。
总之,严肃的对待实验和实验结果的分析是卫检人的必要品质。