细胞培养中常见问题及解决方案免疫学教研室李琦.ppt

广东天然药物研究与开发重点实验室主要研究方向1、抗肿瘤植物药作用机制研究及抗肿瘤新药的开发研究（1）对半边旗有效成分抗肿瘤作用机制的研究获国家自然科学基金和广东省科技攻关计划项目的资助，对半边旗有效成分的提取工艺申报了1项国家发明专利，半边旗二萜类有效成分的医学用途获得了国家发明专利权。

该项研究成果可为申报国家新药提供依据肿瘤对全球的危害不容置疑，癌症是我国民众的第二死因，控制癌症已成我国卫生战略的重点之一。

本研究方向在学科带头人梁念慈教授的主持下，从1990年起开始了从中药中筛选抗肿瘤药物的研究，经过多年的艰苦筛选工作，发现了植物药半边旗具有明显的抗癌活性。

后来，课题组按现代药理学的研究思路，开展了从半边旗中提取有效成分的研究和深入证明这些成分的药理作用机制的研究工作。

经过近10年的努力，该课题组已对植物药半边旗进行了一系列植化、药学、药理学、毒理学研究工作，分别鉴定和证明了半边旗中5F、6F和A组分（均为二萜类）为抗癌活性成份。

这些成分均是国际上首次从半边旗中发现的有抗癌活性的二萜类化合物，据此我们1995年申请了国家发明专利—《半边旗提取物及其医药组合物》（中国专利号：95119380.5），于2002年4月获得了发明专利授权。

本重点实验室成立以来，在已有的基础上，重点探讨了半边旗全草的抗癌活性成份为5F和6F的抗癌作用机制，研究了活性成份5F的提取新工艺，5F的几种医用制剂，初步制定了其中2种制剂的质量标准。

目前本研究室正在对半边旗抗癌活性成份作药效学研究。

本研究方向获得的资助包括国家自然科学基金1项、广东省重点攻关项目1项、厅局级科研课题多项；已获得了国家有发明专利1项，2002年新申请了国家发明专利1项（二萜类有效成分的提取方法，申请号：02149680.3）；先后培养了6名硕士研究生。

本研究在对半边旗抗癌活性成份的分离、提取和鉴定和对半边旗的抗癌活性成份的抗癌作用机理研究方面具有明显的特色和优势，研究成果有明显的创新性和实用性，在同类抗癌中药研究领域具有优势。

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。

(2)松开瓶盖1/4圈。

(3)改用不依赖CO2培养液。

加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。

(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。

(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。

(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

(2)分离培养物，检测支原体。

清洁支架和培养箱。

如发现支原体污染，丢弃培养物。

(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。

细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。

然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。

本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。

1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。

它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。

污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。

为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。

使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。

- 经常检查细胞培养物的外观。

细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。

如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。

- 使用含有抗生素的培养基。

对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。

2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。

以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。

频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。

适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。

- 提供适当的细胞营养来源。

细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。

不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。

确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。

- 坚持细胞培养的无菌操作。

如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。

通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。

3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。

pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。

以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。

使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。

- 确保培养基的配制正确。

细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。

细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一，可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。

然而，细胞培养过程中常常会出现一些问题，如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。

本文将讨论细胞培养中的这些常见问题，并提出相应的解决方法。

1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。

它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。

细胞污染会影响实验结果的准确性，并可能导致细胞系的丢失。

为了解决这个问题，我们可以采取以下措施：（1）经常检查细胞培养器具和培养基，确保其无菌；（2）使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理，以减少污染的风险；（3）定期进行污染检测，例如细胞培养液和工作区的表面。

2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分，但在细胞培养中，过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。

为了减少细胞凋亡的发生，我们可以考虑以下措施：（1）优化培养条件，包括温度、CO2浓度和培养基配方等；（2）定期检查细胞形态和健康状况，及时处理出现凋亡现象的细胞；（3）使用细胞凋亡检测工具，如Annexin V-FITC/PI染色法，来评估细胞凋亡水平。

3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生，可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。

为了避免细胞失活的发生，我们可以尝试以下方法：（1）及时更换培养基，确保细胞获得充足的营养物质；（2）避免过度培养，及时传代细胞；（3）定期鉴定细胞的纯度和活力，并确保培养条件适当；（4）尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。

细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个，还有其他一些问题，例如细胞出现突变、细胞凝固等。

针对这些问题，我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。

同时，注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。

细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。

了解并解决细胞培养中的常见问题，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。

通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择，我们可以克服这些问题，为细胞培养研究的进展做出贡献。

细胞培养常见问题及其解决1. 如何选用特殊细胞系培养基? 如何选用特殊细胞系培养基? 培养某一类型细胞没有固定的培养条件.在 MEM 中培养的细胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同样很 容易生长.总之,首选 MEM 做粘附细胞培养,RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始. 2. 何时须更换培养基? 何时须更换培养基? 视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可. 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 不能.每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之 培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活. 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类? 可否使用与原先培养条件不同之血清种类? 不能.血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极 大的影响.来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会 造成细胞无法存活. 5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误 的使用字眼, 请不要再使用.CS (calf serum) 则是指小牛血清.HS (horseserum) 则是指马血清. 6 培养细胞时应使用 5 % 或 10% CO2?或根本没有影响? ?或根本没有影响? 一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统, 而培养基中 NaHCO3 的含量将决定 细胞培养时应使用的 CO2 浓度. 当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时, 细胞培养时应使用 10 % CO2;当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时, 则应使用 5 % CO2 培养细胞. 7.Hank's 平衡盐溶液 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要 CO2 培养箱.原因是什么?Hank's 平衡盐溶液 要在空气中使用, 培养箱.原因是什么? 要在空气中使用 (HBS)和 Earle's 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高.碳酸氢 钠需用高水平的 CO2 平衡, 以维持溶液的 PH 值. Eagles 液在空气水平的 CO2 中, 溶液会变碱, Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸.如果希望在 CO2 培养箱中保存组织,需要用 Eagles 液, .如果仅仅是清洗 将要在细胞培养基中储存的组织,用 Hanks 液就可以了. 8. 细胞之接种密度为何? 细胞之接种密度为何? 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可.细胞数太少或稀释的太多亦是造成细 胞无法生长之一重要原因. 9. 悬浮性细胞应如何继代处理? 悬浮性细胞应如何继代处理? 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角 瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止.分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加 入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可. 10.冷冻管应如何解冻? 冷冻管应如何解冻? 冷冻管应如何解冻 取出冷冻管后, 须立即放入 37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化, 并注 意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形.另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安 全, 预防冷冻管之爆裂. 11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除 DMSO? 细胞冷冻管解冻培养时, ? 除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞) 在解冻之后, 应直 , 接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可, 如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题. 12. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度?应如何处理? 浓度?应如何处理? 一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na. 第一次开瓶后应立即少量分装于无 菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会.113.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速? 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速? 欲将一般动物细胞离心下来 欲回收动物细胞, 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞 死亡. 14. 细胞冷冻培养基之成份为何? 细胞冷冻培养基之成份为何? 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 % 原来 细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之.注意:由于 DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将 DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成. 15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何? 之等级和无菌过滤之方式为何? 冷冻保存使用之 DMSO 等级, 必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma D2650), 其本身即为 无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于 4°C, 避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会. 若要过滤 DMSO,则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜. 16.冷冻保存细胞之方法? 冷冻保存细胞之方法? 冷冻保存细胞之方法 冷冻保存方法一: 冷冻管置于 4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔 夜) → 液氮槽 vaporphase 长期储存. 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 °C 至–80 °C 以下, 再 放入液氮槽 vapor phase 长期储存. *-20 °C 不可超过 1 小时, 以防止冰晶过大, 造成细胞大量死亡, 亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些. 17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度? 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度? 冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜. 18.培养基中是否须添加抗生素? 培养基中是否须添加抗生素? 培养基中是否须添加抗生素 除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素. 19.应如何避免细胞污染? 应如何避免细胞污染? 应如何避免细胞污染 细胞污染的种类可分成细菌,酵母菌,霉菌,病毒和霉浆菌.主要的污染原因为无菌操作技术不当, 操作室环境不佳,污染之血清和污染之细胞等.严格之无菌操作技术,清洁的环境,与品质良好之细 胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法. 20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理? 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理? 如果细胞发生微生物污染时 原则上:直接灭菌后丢弃之. 当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染.首先,确定污染物是细菌,真菌,支原体或 酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查 HEPA 过滤器. 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素 产生毒性的剂量水平.这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要.下面是推 荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤. 1.在无抗生素的培养基中消化,计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度. 2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中.在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每 一个孔中.例如,两性霉素 B 推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml. 3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆. 4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度 2～3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2～3 代. 5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代. 6.重复步骤 4. 7.在无抗生素的培养基中培养 4～6 代,确定污染是否以已被消除. 21.支原体 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状? 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状? 支原体 不能.除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之. 22.支原体污染会对细胞培养有何影响? 支原体污染会对细胞培养有何影响? 支原体污染会对细胞培养有何影响 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据.故进行实验前,必须确认细胞2为 mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义. 23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理? 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理? 直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株. 24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁? 培养箱之水盘如何保持清洁? 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之. 25.为何培养基保存于 4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且 pH 值会越来越偏碱性? 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 值会越来越偏碱性? 为何培养基保存于 培养基保存于 4 °C 冰箱中, 培养基内之 CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性.而培养基中 之酸碱指示剂(通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红.培养基偏碱之结果, 将造成细 胞生长停滞或死亡.若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之 CO2, 以调整 pH 值. 26. 各种细胞培养用的 dish,flask 是否均相同? 是否均相同? , 不同厂牌的 dish 或 flask, 其所 coating 的 polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有 太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异. 27. 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形? 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形? 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的 物理性损伤, 以及细胞流失.建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即 可. 28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因? 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因? 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳.血 清使用错误或血清的品质不佳.解冻过程错误.冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心.悬浮细胞误 认为死细胞.培养温度使用错误.细胞置于–80 °C 太久. 30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? 谷氨酰胺在细胞培养中重要吗? 谷氨酰胺在细胞培养中重要吗 它在溶液中不稳定吗? L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的.脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源,参与蛋白 质的合成和核酸代谢.L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终 定论.L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性. 31.GlutaMAX-I 是什么?培养细胞如何利用 GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? 是什么? ?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护.一种肽酶 逐渐裂解二肽,释放 L-谷氨酰胺供利用. GlutaMAX-I 二肽非常稳定,即使在 121 磅灭菌 20 分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在 相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解. 32.什么培养基中可以省去加酚红? 什么培养基中可以省去加酚红? 什么培养基中可以省去加酚红 酚红在培养基中用作 PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色.研究表明,酚 红可以模拟固醇类激素的作用, (特别是雌激素) .为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞 时,用不加酚红的培养基.由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红 的培养基. 33.如何用台盼兰计数活细胞? 如何用台盼兰计数活细胞? 如何用台盼兰计数活细胞 用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/毫升,在 0.1 毫升细胞悬液中加 0.1 毫升 0.4%的台盼 兰溶液.轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞.活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色细胞是死 细胞. 34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么? 培养基中丙酮酸钠的作用是什么? 培养基中丙酮酸钠的作用是什么 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡 萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠. 35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么? 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗? 的目的是什么? 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性.EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的 活性.建议胰蛋白酶处理细胞前,用 EDTA 清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子. 36.室温下配制的 Tris-HCl 溶液,在 37℃使用时 PH 值是多少? 溶液, 值是多少? 室温下配制的 ℃3缓冲液 PH 值随温度变化而变化.下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃,25℃,37℃时,不同 PH 值.50mM Tris-HC 溶液在 4℃,25℃,37℃时,不同 PH 值 4°C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 25°C 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 37°C 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.537.如何从 T25 瓶中转移 sf9 细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 如何从 细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 我们推荐使用脱落细胞的方法,此技术破坏性最小,生活力最高.通过使用巴斯德吸液管,让细胞上 培养基流动.作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶.只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细 胞. 38.胰酶消化一个 T25 瓶的 sf9 细胞: 细胞: 胰酶消化一个 1. 去除培养基. 2. 用 2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除 PBS. 3. 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA(恰好覆盖细胞表面) . 4. 37 ℃孵育 5 到 10 分钟.在仪器下检测看到 5 分钟后它们正在向上移动. 5. 向细胞中加入 2ml 细胞培养液,移入锥形管,用 2ml 培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中. (培养基 中的 FBS 终止了胰酶的活性. ) 6. 离心(1100rpm)沉淀细胞.去除培养基. 7. 用新的培养基重新悬浮细胞.传代. 39.在 Sf9, Sf21, 和 high Five 细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 在 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为 10 单位/毫升细胞悬液. 40.在重新冻存 sf9 细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗? 细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗? 在重新冻存 通常情况当细胞经过 30 次传代后,应该返回冻存.无论什么时候计数时,都应该检查细胞活力.如果 超过 95%的细胞保持有活力和在大约 30 小时左右加倍, 细胞仍然可以使用. 如果活力和加倍时间下降, 它们的感染力将不在是有效的. 41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,在放置几天后颜色变紫 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基, 色变紫? 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基 在放置几天后颜色变紫 这主要是由于在暴露到周围的 CO2 水平时,碳酸氢纳导致了 pH 值的上升.您可以在使用前松开瓶口, 在 CO2 培养箱孵育培养基 10-15 分钟,来校正溶液的 pH 值(确定松开瓶口以保证气体交换) . 42. 细胞培养基偶然被冻,可否继续使用? 细胞培养基偶然被冻,可否继续使用? 如果细胞培养基偶然被冻,您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生.如果没有沉淀产生,培养基可 以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基. 43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗? 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗? 当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%.血清蛋白会结合4和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平. 44. 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗? 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗? 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清 中的基本成分在解冻后就开始降解. 45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗? 培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗? 培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗 大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和 沉淀,将会影响它的性能. 46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在 4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液 为什么要在溶解的一周内使用贮存在 ℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 胰蛋白酶在 4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过 30 分钟,就会变得不稳定. 47.保存血清最好的方法 保存血清最好的方法? 保存血清最好的方法 我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃.若存放于 4℃时,请勿超过一个月.若一次无法用完一瓶,建议 无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻. 48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 将血清从冷冻箱取出后,先置于 2～8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融.但必须注意的是,融 解过程中必须规则地摇晃均匀. 49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋 白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一.但这些絮状 沉淀物,并不影响血清本身的质量. 若欲去除这些絮状沉淀物, 可以将血清分装至无菌离心管内, 400g 稍微离心,上清液即可接着加入培 以 养基内一起过滤.最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜. 50. 为什么要热灭活血清 为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统.激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺, 激活淋巴细胞和巨噬细胞.在免疫学研究,培养 ES 细胞,平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清. 51. 有必要做热灭活吗 有必要做热灭活吗? 实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的.经此处理过的血清对细胞 的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细 胞生长速率的降低.而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下 观察,像是"小黑点" ,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在 37℃环境中,又会使此 沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增. 若非必须,可以不需要做热处理这一步.不但节省时间,更确保血清的质量! 52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 有些胎牛血清产品没有预老化,储存在 2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素,纤维蛋 白原,玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊.这应该不会影响血清的质量.推荐在-20℃ 储存胎牛血清,避免反复冻融. 53. 如何避免沉淀物的产生 如何避免沉淀物的产生? 我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作: (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至 4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如 -20℃至 37℃),非常容易产生沉淀物. (2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生. (3)请勿将血清置于 37℃太久.若在 37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分 也会因此受到损害,而影响血清的质量. (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤. (5)若必须做血清的热灭活,请遵守 56℃,30 分钟的原则,并且随时摇晃均匀.温度过高,时间过久或 摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多.5。

细胞培养过程中的常见问题及其解决方法一、培养液pH 值变化太快可能原因：1、CO2 张力不对；2、培养瓶盖拧得太紧；3、NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足；4、培养液中盐浓度不正确；5、细菌、酵母或真菌污染。

解决方法：1、（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％到10％。

（2）改用不依赖CO2 培养液。

2、松开瓶盖1/4 圈。

3、加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。

4、在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。

5、丢弃培养物或用抗生素除菌。

二、培养液出现沉淀，但pH值不变解决方法：1、用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。

冰冻保存培养液。

2、用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。

3、将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

三、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化原因：细菌或真菌污染解决方法：丢弃培养物。

或用抗生素除菌。

四、培养细胞不贴壁原因：1、胰蛋白酶消化过度；2、支原体污染；3、培养液中无贴壁因子。

解决方法：1、缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

2、分离培养物，检测支原体。

清洁支架和培养箱。

如发现支原体污染，丢弃培物。

五、悬浮细胞成簇原因：1、培养液中含钙、镁离子；2、支原体污染；3、蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA。

解决方法：1、用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。

2、分离培养物，检测支原体。

如发现支原体污染，丢弃培养物。

3、用DNase I 处理细胞。

六、培养细胞死亡原因：1、培养箱内无CO2；2、培养箱内温度波动太大；3、细胞冻存或复苏过程中损伤；4、培养液渗透压不正确；5、培养液种有毒代谢产物堆积。

解决方法：1、检测培养箱内CO2；2、检查培养箱内温度；3、取新的保存细胞种；4、检测培养液渗透压，注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg；5、加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压；6、换入新鲜培养液。

细胞培养过程中的常见问题
1.细胞污染：
①真菌污染：能看到培养液带有白色头发丝样团状物。

②细菌污染：培养液变浑浊，经常见到米汤样、黄色液体。

解决措施：丢弃污染的培养皿，用75%酒精棉球擦洗培养箱，并用紫外照射1小时。

2.在细胞培养过程中发现贴壁细胞表面悬浮很多死细胞怎么解决？
解决方法：用PBS洗两遍之后，加胰酶进去，晃一晃，迅速将胰酶倒出，再加PBS洗一下，再加胰酶正常消化。

死细胞由于粘附能力很弱，第一次加胰酶进去以后会掉下来，第二次加胰酶下来的细胞才是活性比较强的细胞。

整完一次之后，再次传代方法同上，一般2-3次之后，细胞就完好如初了。

3.细胞胞质疏松，状态不好，繁殖速度低于正常水平怎么办？
解决方法：一是适当提高培养液中胎牛血清浓度；二是细胞传代过程中减少稀释比例，提高细胞密度有利细胞生长。

预防细胞质疏松的方法是避免传代次数过多、传代过程中稀释比例过高、胰酶消化时间过长等。

细胞培养教学中的常见问题及应对措施细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术,是生命科学工作者必备的实验技能。

细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种因素的影响[1]。

在多年的教学实践中,笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直接影响到教学的顺利进行,针对这些问题,笔者采取了一些应对措施,取得了较好的效果。

1 细胞培养教学中的一些常见问题1.1 培养的细胞易被污染离体培养的细胞没有抗感染能力,因此防止污染是细胞培养成败的关键。

笔者在教学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。

1.2 细胞培养对操作环境要求高,不易组织教学细胞培养需要在无菌室的超净台中进行,空间较小,教师无法面对大量的学生进行实验示教 ,因此在组织教学上有一定的困难。

1.3 实验过程较长,操作步骤多,不易监控细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多,实验过程长,操作步骤多。

进行一轮完整的实验,往往需数天时间,而且在实验过程中,学生来做实验的时间不固定,因此教师不容易对学生的实验全过程进行监控。

1.4 实验评价标准单一,不适于这一类实验的教学以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据,其缺陷是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术,主要体现在实验的过程中。

笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重点实验室学习和进修,虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术,但其做细胞培养实验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。

笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验教学的问题,综合这些经验,提出了相应的处理对策。

2 应对措施2.1 完善细胞培养室设施,规范实验操作步骤2.1.1 细胞培养室应单独隔离出来专用,能建立一定清洁级别的培养室是最好的,考虑到用于教学的实验室需要较大的面积,可能不易达到这样的清洁级别要求,但至少要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2]。

细胞培养常见问题问题1：培养液pH 值变化太快可能原因（1）CO2 张力不对（2）培养瓶盖拧得太紧（3）NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足（4）培养液中盐浓度不正确（5）细菌、酵母或真菌污染建议解决方法（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到 3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％到10％。

（2）松开瓶盖1/4 圈。

（3）改用不依赖CO2 培养液。

加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。

（4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。

（5）丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因（1）洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来（2）冰冻保存培养液建议解决方法（1）用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。

（2）将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

问题3：培养液出现沉淀，同时pH 发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题4：培养细胞不贴壁可能原因（1）胰蛋白酶消化过度（2）支原体污染（3）培养瓶瓶底不干净（4）培养液pH值过碱（NaHCO3分解）（5）消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当（6）细胞老化（如传代前细胞已汇合导致失去贴附性）（7）接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法（1）缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

（2）分离培养物，检测支原体。

清洁支架和培养箱。

如发现支原体污染，丢弃培养物。

（3）注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶（4）使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2（将培养液敞口放入培养箱也可）（5）重新配置消化液或培养液（6）启用新的保种细胞（7）调节最佳接种细胞浓度感谢您的阅读，祝您生活愉快。

表：细胞培养失败常见原因及对策
出现问题可能原因解决办法
培养基中pH 错误的CO2浓度调节C02浓度
快速改变[NaHC02]2-3.7g/L,[C02]5-10%
培养瓶盖子过紧稍放松盖子
缓冲液量不足加HEPES至最终浓度为10-20mM
细菌、酵母和丢弃培养物、避免污染
真菌污染
细胞不贴壁过量的胰酶消化减少胰酶浓度或消化时间
培养基中无粘附因子加大血清浓度或增加粘附因子
细菌、霉菌、支原体污染检查并去除污染或丢弃
物理、化学污染去除相关污染
细胞生长速度降低改变培养基或血清比较培养基中成分,新旧血清比较
缺乏促进生长成分传代培养,加新鲜培养基和
如谷氨酰胺或生长因子生长促进成分
培养基储存不当保存在2-8℃，
血清培养基应尽量避光
初次细胞接种量少增加细胞接种数量
细胞衰老取得新细胞株
低度细菌和真菌污染无抗生素的培养基,如被污染，
则丢弃
支原体污染隔离培养,如污染,丢弃
细胞死亡无C02 检测C02
温度波动检验温度
抗生素浓度超量有毒性少量使用抗生素
细胞复苏受损重新复苏
渗透压错误检测培养基渗透压
产生毒性代谢物去除并更换培养基
细胞成团悬浮Ca，Mg离子存在用无Ca2+，Mg2离子的平衡
盐溶液清洗细胞
支原体污染隔离培养,检验支原体污
染,
如已经污染,则丢弃
胰酶过量,细胞DNA释放用DNase处理细胞
细胞形态、生长
状况改变细胞间污染更换细胞。