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一、实验目的1. 了解槐米中黄酮类化合物的提取和测定方法。
2. 掌握黄酮类化合物含量的测定原理及操作步骤。
3. 掌握紫外可见分光光度计的使用方法。
二、实验原理黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的天然化合物，具有多种生物活性。
槐米中的黄酮类化合物含量较高，具有一定的药用价值。
本实验采用铝离子络合显色法测定槐米中的总黄酮含量。
该方法的原理是：利用溶液中的铝离子与黄酮类化合物中的羟基或甲氧基发生络合作用，在强酸条件下形成稳定的有色络合物。
最后，利用紫外可见分光光度计测定产物的吸光度，从而计算出黄酮类化合物的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：槐米、无水乙醇、铝离子溶液、盐酸、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外可见分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、容量瓶、试管等。
四、实验步骤1. 槐米样品处理：将槐米样品研磨成粉末，过筛后备用。
2. 标准曲线绘制：（1）准确称取一定量的标准品（如芦丁）0.1g，用无水乙醇溶解，定容至100mL 容量瓶中，得到浓度为100mg/L的标准溶液。
（2）分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准溶液于10mL容量瓶中，加入2mL铝离子溶液和5mL盐酸，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。
（3）将上述溶液在特定波长下测定吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：（1）准确称取一定量的槐米样品粉末0.1g，用无水乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，得到样品溶液。
（2）分别取1.0mL样品溶液于10mL容量瓶中，加入2mL铝离子溶液和5mL盐酸，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。
（3）将上述溶液在特定波长下测定吸光度。
4. 结果计算：根据标准曲线，查得样品溶液中黄酮类化合物的浓度。
根据下式计算样品中黄酮类化合物的含量：黄酮类化合物含量（mg/g）= 浓度（mg/L）× 10 × 样品质量（g） / 样品体积（mL）五、实验结果与分析1. 标准曲线：在波长510nm处，绘制标准曲线，线性范围为0.5～2.5mg/L。
槐花中黄酮类物质提取工艺的研究槐花中的黄酮类物质是一种重要的天然活性成分，可以用于预防和治疗疾病，用于药物研发、化妆品研发和营养保健制品研发等方面具有重要的价值。
研究人员开展了大量有关槐花中黄酮类物质提取工艺的研究，以有效地获取槐花中的黄酮类物质，有助于发挥其有效活性成分的潜力和功能，为提高槐花中黄酮类物质的生产和使用效率提供有效的帮助。
槐花中的黄酮类物质的提取多种多样，比如溶剂提取、超声波提取、超临界流体提取、色谱提取等。
在槐花中黄酮类物质的提取中，溶剂提取是最简单的方法。
一般可以采用醇提取、水提取、水-乙醇混合提取等提取方法，选择最适合提取槐花中黄酮类物质的溶剂，以获得最佳效果。
另外，超声波提取也是目前常用的一种黄酮类物质提取方法，可以在较短时间内获得较高的提取效率，同时减少提取损失。
而超临界流体提取是一种不污染、高效的提取方法，具有温和的提取条件，使提取物质更容易释放，从而提高提取效果。
最后，还有色谱提取，是一种能够有效分离槐花中黄酮类物质的提取方法，该方法不仅可以提取活性成分有效，而且具有很高的选择性，在提取槐花中黄酮类物质方面具有重要的应用价值。
槐花中黄酮类物质提取工艺的研究，不仅可以有效提高不同提取方法的提取效率，而且还可以提高槐花的农业产值，提高槐花中黄酮类物质的产品化效率，为提高槐花中黄酮类物质的商业化应用提供有力的技术支持。
此外，还可以利用槐花中的黄酮类物质开发出新药，从而实现药物研发、化妆品研发、营养保健制品研发等方面的实用价值。
在槐花中黄酮类物质提取工艺研究方面，在过去的几十年间展开了大量的实验，其中研究超声波提取、超临界流体提取、色谱提取等技术取得了显著的进展。
未来，学者们将继续深入研究提取槐花中黄酮类物质的新技术和新方法，探索更有效的提取技术，以实现大规模的提取，并有效发挥槐花中的黄酮类物质的活性成分的潜力和功能，为药物研发、化妆品研发和营养保健制品研发等提供重要的技术支持。
从槐米中提取分离黄酮的工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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[适用对象] 中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业[实验学时]一、实验目地要求学习黄酮类化合物地提取、分离和检识，通过实验要求：（）了解沸水提取黄酮类化合物地原理和操作.（）了解由芸香苷水解制取槲皮素地方法.（）掌握黄酮类化合物地主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分地检识方法.二、实验原理由槐花中提取芸香苷地方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中地溶解度差异地特性进行提取和精制.纸色谱地分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数地不同而达到分离目地.文档来自于网络搜索三、仪器设备烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽，毛细管等.四、相关知识点槐花为豆科植物槐 .地干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖.文档来自于网络搜索芸香苷（），分子式 ，分子量，淡黄色针状结晶，178℃.难溶于冷水（﹕），略溶于热水（﹕），溶于热甲醇（﹕），冷甲醇（﹕），热乙醇（﹕），冷乙醇（﹕），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中.文档来自于网络搜索槲皮素（），分子式 ，分子量，黄色针状结晶，.314℃（分解）.溶于热乙醇（﹕），冷乙醇（﹕），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水.文档来自于网络搜索OO O H OH OHOHOR五、实验步骤（一）芸香苷、槲皮素和糖地纸色谱鉴定、点样：取新华一号色谱滤纸，规格 × ，在滤纸下端约 处用铅笔画一直线，间隔 分别点上下列样品或标准溶液：文档来自于网络搜索 （）糖样品溶液 （）标准葡萄糖溶液（）标准鼠李糖溶液 （）芸香苷样品甲醇溶液（）芸香苷标准品溶液 （） 槲皮素样品甲醇溶液（）槲皮素标准品溶液、展开剂：正丁醇醋酸水（﹕﹕）上层上行展开.、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置.待溶剂挥尽后，在（）与（）点之间剪开，分别显色.文档来自于网络搜索 （）糖地显色：喷苯胺邻苯二甲酸试剂，在105℃烘分钟，显棕色斑点.计算并比较样品和标准品地值.文档来自于网络搜索 （）黄酮化合物地显色：①可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑点.②经氨气薰后再观察.③待氨气挥尽后，喷甲醇溶液，再观察.④计算并比较样品与标准品地值.（二）芸香苷和槲皮素性质试验、酸性试验：取小试管支，每支一组，第一组每管中加入芸香苷，第二组每管中加入槲皮素，每组四管中分别加入稀氨水、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液各，振摇后观察各管溶解情况.溶解地溶液应呈黄色.再加浓盐酸数滴酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或产生混浊.文档来自于网络搜索、反应：取试样置小试管中，加乙醇溶解，加α萘酚试剂滴，摇匀.倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约静置.观察两层溶液地界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖地结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、试验：取试样数，溶于热水中，加斐林氏试剂甲、乙等量混合液，沸水浴上加热，如产生氧化亚铜地暗红色或黄色沉淀表示有还原糖或其它还原性物质.充分加热作用后滤去沉淀，滤液滴加浓盐酸酸化，在水浴上加热水解，水解液以中和，再进行斐林氏试验，此时显阳性反应者表示样品为糖苷化合物.比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、盐酸镁粉反应：取芸香苷，加乙醇，在水浴上加热溶解，加镁粉约，滴加数滴浓盐酸，溶液由黄色渐变红色者表示有黄酮类化合物.以同法试验槲皮素.文档来自于网络搜索如用锌粉代替镁粉，则芸香苷（羟基与糖结合成苷）仍有作用，而槲皮素（黄酮醇类）不呈还原显色反应.因此可区别两者.文档来自于网络搜索、锆柠檬酸反应：取样品，加甲醇，在水浴上加热溶解，再加二氯氧锆甲醇溶液滴，凡有羟基或羟基地黄酮即呈鲜黄色.然后加柠檬酸甲醇溶液滴，有羟基地黄酮黄色不褪.比较芸香苷和槲皮素地不同.文档来自于网络搜索、三氯化铝反应：取样品溶于甲醇中，加三氯化铝甲醇溶液滴，黄酮类呈鲜黄色，并有荧光.文档来自于网络搜索六、实验报告要求应包括原理描述、实验流程、数据记录、解决问题地能力、实验结果、实验效果及建议等.七、思考题、检识黄酮类化合物地常用化学方法有哪些？、本实验中各种色谱地原理是什么？解释化合物结构与值地关系.、试讨论苷类成分地检识程序.八、实验成绩评定方法本门实验课程考核成绩占课程总成绩地％，该实验考核成绩占实验总成绩地％.考核分实验预习、实验过程操作、实验报告等三个方面，其成绩计算为预习实验占（包括原理描述、实验流程）、实验过程操作占％（包括数据记录、解决问题地能力）、实验报告占％（包括实验结果、实验效果）.文档来自于网络搜索。
实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别一、实验目的（1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。
（2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。
二、实验原理芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。
现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。
尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。
槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。
芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。
芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。
溶解度情况如下：水：1:10000(冷)，1:200(热)甲醇：1:100(冷)，1:9(热)乙醇：1:300(冷)，1:30(热)吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热)不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。
可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。
芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。
再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。
利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。
三、实验内容（一）芦丁(芸香苷)的提取1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。
称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤饼用水洗3-4次），干燥后得粗品。
槐花对照提取物的制备及槐花中4个黄酮类成分的含量测定目的：制备槐花对照提取物，并以其为对照测定槐花中4个黄酮类成分含量。
方法：用水提法制备槐花对照提取物；采用高效液相色谱法测定其中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的含量；色谱柱为Diamonsil C18（2），流动相为甲醇-1%冰乙酸水溶液（梯度洗脱），检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。
以槐花对照提取物为对照测定槐花中4个成分的含量，并与以化学对照品为对照的测定结果进行比较。
结果：在所制槐花对照提取物中，4个成分的含量占86.85%；芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的检测进样量线性范围分别为0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～0.136 μg（r均≥0.999 5）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤2.30%（n=6），加样回收率分别为100.4%、96.99%、102.3%、100.9%（RSD分别为2.51%、1.58%、2.97%、3.20%，n=6）。
两种方法中4个成分的含量测定结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。
结论：以制备的槐花对照提取物为对照建立的测定方法操作简便、重现性好，并能同时测定槐花中4个成分的含量，可用于槐花饮片的质量控制。
ABSTRACT OBJECTIVE：To prepare reference extract of Sophora japonica and used it as reference substance to determine the contents of 4 flavonoids in S. japonica. METHODS：The reference extract of S. japonica was prepared by water extraction. HPLC method was adopted to determine the contents of rutin，kaempferol-3-O-rutinoside，narcissoside and quercetin. The determination was performed on Diamonsil C18（2）column with mobile phase consisted of methanol-1% acetic acid （gradient elution）. The detection wavelength was set at 360 nm，the column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL. The contents of 4 components in S. japonica were determined by using reference extract of S. japonica as reference，and compared with the results with chemical control as reference. RESULTS：In prepared reference extract of S. japonica，the contents of 4 components were 86.85%. The linear range was 0.076 8-3.07 μg for rutin，0.002 24-0.089 6 μg for kaempfer ol 3-O-rutinoside，0.001 59-0.063 7 μg for narcissoside and 0.003 40-0.136 μg for quercetin （all r≥0.999 5）. RSD of precision，stability and reproducibility tests were all ≤2.30% （n=6）. The recoveries were 100.4%，96.99%，102.3% and 100.9%（RSD were 2.51%， 1.58%， 2.97%， 3.20%，n=6），respectively. There was no statistical significance in the content determination of 4 components between 2 kinds of methods （P>0.05）. CONCLUSIONS：Using prepared reference extract of S. japonica as reference，established method is simple and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 4 components in S. japonica and quality control of S. japonica decoction piece.KEYWORDS Sophora japonica；Reference extract；Preparation；HPLC；Flavonoids；Content determination對照提取物是三大类中药标准物质（中药化学对照品、对照药材、对照提取物）之一，为非单体成分的对照物[1-3]。
槐花中黄酮类化合物分离和鉴定[适用对象] 中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业[实验学时]9一、实验目的要求学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求：（1）了解沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。
（2）了解由芸香苷水解制取槲皮素的方法。
（3）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。
二、实验原理由槐花中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制。
纸色谱的分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数的不同而达到分离目的。
三、仪器设备烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽，毛细管等。
四、相关知识点槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达12~20%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。
芸香苷（rutoside），分子式C27 H30 O16，分子量610.51，淡黄色针状结晶，mp.177~178℃。
难溶于冷水（1﹕8000），略溶于热水（1﹕200），溶于热甲醇（1﹕7），冷甲醇（1﹕100），热乙醇（1﹕30），冷乙醇（1﹕650），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。
槲皮素（quercetin ），分子式C 15 H 10 O 7，分子量302.23，黄色针状结晶，mp.314℃（分解）。
溶于热乙醇（1﹕23），冷乙醇（1﹕300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水。
OOO H O H O HO HO R五、实验步骤（一）芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱鉴定1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20 cm ×20 cm ，在滤纸下端约2 cm 处用铅笔画一直线，间隔2 cm 分别点上下列样品或标准溶液：（1）糖样品溶液 （2）标准葡萄糖溶液（3）标准鼠李糖溶液 （4）芸香苷样品甲醇溶液（5）芸香苷标准品溶液 （6） 槲皮素样品甲醇溶液（7）槲皮素标准品溶液2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4﹕1﹕5）上层上行展开。
槐花米中芦丁的提取分离与鉴定实验一预试；苷的碱提取，酸沉淀；薄层层析铺板。
实验二产品的精制:重结晶；苷的水解。
实验三苷、苷元的定性鉴定；甙、甙元的TLC鉴定；糖的纸层析鉴定。
槐花米中芦丁的提取分离与鉴定（一）预试；苷的碱提取，酸沉淀；薄层层析铺板。
（二）产品的精制:重结晶；苷的水解。
（三）苷、苷元的定性鉴定；甙、甙元的TLC鉴定；糖的纸层析鉴定。
教学目的：1．掌握酸碱法提取黄酮苷类的原理及方法。
2．掌握化学鉴别试验、苷水解、薄层层检查等手段在苷类结构鉴定上的作用。
已知重要成分及其性质1．芦丁（芸香苷，rutin）淡黄色针晶，水中结晶者含3分结晶水，C27H30O16·3H2O 100mmHg和110℃加热12小时后，变为无水物，无水物于25℃变棕，115～7℃软化，214～5℃发泡分解，1g芦丁溶于约300ml冷水，200ml沸水，7ml沸甲醇，溶吡啶，甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。
2．槲皮素（Guereetin）为芦丁的苷元，C15H10O7，MW302.23；含二分子结晶水为黄色针晶，（稀乙醇），5～7℃失水，314℃解，1g溶于290ml无水乙醇、23ml沸乙醇，溶于冰醋一般在碱水中溶解显黄色，几不溶于水。
OHOOR OHOHR=glu rha芦丁R=OH槲皮素3．皂苷（Saponin）粗品为白色粉末，mp 210℃～20℃（dec）。
易溶于吡啶。
能溶于200倍的甲醇，酸水解得下列两种苷元及糖。
糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。
（1）白桦酯醇（Betulin）无色针晶，mp215～2℃，能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；难溶于石油醚和水。
HO OHHOCH2OH（2）槐花二醇（Sophoradiol）无色针晶，mp219~20℃或224℃，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。
整套实验的过程：预试——提取分离——鉴定实验一预试；甙的碱提取，酸沉淀实验目的通过系统预试，了解检品中含有哪些类型的成分，可能含有哪些化学类型的成分，为进一步提取分离有效成分提供线索。
实验从槐花米中提取芦丁一、实验目的1．学习黄酮苷类化合物的提取方法。
2．掌握趁热过滤及重结晶等基体操作二、实验原理芦丁（Rutin ）又称芸香苷（Rutioside ）有调节毛细血管壁的渗透性的作用，临床上用作毛细血管止血药，作为高血压症的辅助治疗药物。
芦丁存在于槐花米和荞麦叶中，槐花米是槐系豆科槐属植物的花蕾，含芦丁量高达12%~16%，荞麦叶中含8%，芦丁是黄酮类植物的一种成分，黄酮类植物成分是存在于植物界并具有以下基本结构的一类化合物：就黄色色素而言，它们的分子中都有一个酮式羰基又显黄色，所以称为黄酮。
黄酮的中草药成分几乎都带有一个以上羟基，还可能有甲氧基、烃基、烃氧基等其它取代基，3、5、7、3'、4'、几个位置上有羟基或甲氧基的机会最多，6、8、1'、2'、等位置上有取代基的成分比较少见。
由于黄酮类化合物结构中的羟基较多，大多数情况下是一元苷，也有二元苷。
芦丁是黄酮苷，其结构如下：黄酮骨架OO123456782'3'4'5'6'芦丁（Rutin ）三、基本操作训练【操作步骤】1、 称取3g 槐花米于研钵中研成粉状，置于50mL 烧杯中，加入30mL 饱和石灰水溶液，加热至沸，并不断搅拌，煮沸一刻钟后，抽滤，滤渣再用20mL 饱和石灰水溶液煮沸10min ，合并滤液用15%盐酸中和，调节PH=3-4,放置1-2小时,使沉淀，抽滤，水洗，得芦丁粗产物。
2、 将制得的芦丁粗品置于50ml 烧杯中，加入30ml 水，加热至沸，并不断搅拌，并慢慢加入10mL饱和石灰水溶液，调节PH=8-9，等沉淀溶解后，趁热过滤，滤液置于50mL烧杯中，用15%盐酸调PH=4-5，静置30min，芦丁以浅黄色结晶析出，抽滤，水洗，烘干得芦丁纯品。
【实验流程】槐花米粉末煮沸提取，抽滤饱和石灰水粗提液中和、沉淀、抽滤粗提物洗涤水粗品煮沸、溶解溶液趁热过滤滤液酸化，静置，过滤结晶洗涤芦丁15%HCl四、实验关键及注意事项1、加入饱和石灰水溶液既可以达到碱溶解提取芦丁的目的，又可以除去槐花米中大量多糖粘液质。
实验三槐花米黄酮苷元的提纯和鉴定槐米( Sophorae Flos) 为豆科植物槐树( Sopho japonica L)的干燥花及花蕾.夏季花开放或花蕾形成时采收，及时干燥，除去枝、梗及杂质，前者习称”槐花”后者习称“槐米”[1]。
历来用作止血药物治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻血等症。
槐米用作药用已有2000多年历史，槐米中的主要化学成分是芦丁（亦称芸香苷Rutin），含量可高达23.5%。
具有不可多得的治病防病作用，目前主要用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血，降低人体血脂和胆固醇，是治疗高血压"心血管疾病"胃病"皮肤病"糖尿病等多种疾病的良药; 而且它还有抗菌和抗放射作用，可用于食品、化妆品的添加剂和着色剂；芦丁也用于药物的中间体，合成羟乙基芦丁等药物，可治疗闭塞性脑血管疾病[2]。
Kite等[7]的研究显示，槐米中以槲皮素为苷元的黄酮化合物主要有4种，其中芦丁含量约占所有槲皮素苷的90%，是槐米中含量最高的黄酮苷成分.本实验的提取部分用超声提取新技术进行提取。
一、主要黄酮类成分的物理性质1.芸香苷(Rutin)淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174~178℃，无水物为188℃。
溶解度：溶剂溶解度%水MeOH EtOH 吡啶冷0.0013 1.0 0.36 8.5 热 0.55 11.2 3.5 易溶 不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂。
易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。
可溶于浓硫酸呈棕黄色。
加水稀释后又析出。
2.槲皮素（quercetin ）为黄色结晶。
熔点：含2分子结晶水物313℃~314℃，无水物316℃。
溶解度：乙醇：1：290，无水乙醇1：23（沸时）。
可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。
不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。
二、实验目的1.了解超声提取的新技术；2.了解黄酮类化合物的一般性质；3.学习聚酰胺TCL 法在黄酮类化合物中的应用；4.掌握有黄铜苷类水解制取黄铜苷元的方法。
三、实验原理1.利用芦丁可溶于热水、难溶于冷水及易溶于碱水、难溶于酸水的性质进行提取。
2.加石灰水的原因:黄酮类物质（除花色素外）因交叉共轭系统和苷上糖链的存在而具有一定的极性，但在水中较难溶解。
大多数黄酮类物质具有酚羟基，因此可以用碱性水或碱性醇浸出，再经酸化而得。
氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多，纯化不便。
石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀，有利于浸液纯化。
因此，本试验选择石灰乳调节3.加入硼砂的原因：碱性条件有利于提取率的提高,但芦丁分子中因含有邻二酚羟基,性质不太稳定,暴露于空气中缓缓分解变为暗褐色,在碱性条件下更容易被氧化分解,加入适量硼砂能将邻二酚羟基保护起来而有利于芦丁的提取,硼砂的加入量与提取物(槐米)的比例以0·025g~0·035g: 1g为宜。
4.超声提取法:通过液体介质引起的空化作用可造成植物细胞壁的瞬间破裂,便于提取溶剂渗透到植物细胞中,从而加速药材中有效成分的溶出,并且超声波提取不会改变有效成分的结构,同时减少溶媒用量、提高了提取效率，因而成为一种植物有效成分提取的新方法。
魏彩霞等[3]在提取功率、超声提取时间、提取次数、料液比等单因素考察试验的基础上，通过正交设计进行三因素三水平试验。
最佳超声辅助提取工艺条件为: 超声频率20kHz，提取功率800W，提取温度60℃，料液比1∶20，超声提取2次，每次30min; 芦丁提取率为18. 25%，该提取工艺条件简单可行、速度快，可提高槐米中芦丁的产率。
5.黄酮苷可通过酸水解，得到苷元及糖，并可通过TCL、PC及乙酰化物制备进行鉴识。
6.本实验涉及的知识点：超声提取、重结晶、聚酰胺色谱、水解法测定苷的结构。
四、实验试剂和仪器试剂：槐花米50g、蒸馏水、石灰乳、浓盐水、MeOH、100ml 1%H2SO4、300ml甲醇、鼠李糖对照品、葡萄糖对照品、n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液、苯胺-邻苯二甲酸盐试剂、芦丁对照品、槲皮素对照品、80%乙醇、浓氨水、1% AlCl3醇溶液、10% α-萘酚乙醇液、浓硫酸、镁粉、三氯化铁醇溶液、1%AlCl3乙醇溶液、1%醋酸镁甲醇溶液、2%ZrOCl2甲醇溶液、2%柠檬酸甲醇溶液，5%亚硝酸钠，10%硝酸铝，4.3%氢氧化钠。
仪器：电子天平、研钵、500ml烧杯、100ml及10ml量筒、玻璃棒、pH试纸、超声清洗器、沸石、橡胶软管、水浴锅、抽滤漏斗、抽滤瓶、（红外灯）、250ml及500ml圆底烧瓶、球形冷凝管、电陶炉、旋转蒸发仪、分液漏斗、滤纸条、聚酰胺薄层板、展开槽、毛细管、紫外灯、小锥形瓶（或小试管）若干、紫外分光光度计。
五．实验流程：六、实验方法1.芦丁的提取称取槐花米50g，研碎后置于1000ml的烧杯中，加热至70℃，加石灰乳调节pH10~11，加入硼砂1g[4]，浸润20min，然后超声提取30min（保持pH不变）,二次（第一次加水500ml，第二次加水450ml），合并滤液，在60~70℃下，用浓盐酸酸化至pH4~5，静置1h，减压过滤，取沉淀即得芦丁粗品。
2.芦丁的精制上述沉淀称重后（湿品）加入25~30倍量的热水溶解，加热煮沸15min，趁热过滤，弃去不溶物，静置，放冷析出结晶、过滤，结晶自然干燥（或在红外灯下干燥、60~70℃），得芦丁水精制品。
再取1g芦丁水精制品用MeOH重结晶（1:10~15）3.芦丁的水解称取芦丁水精制液1g，置250ml圆底烧瓶中加1%H2SO4100ml直火回流30min（注意观察现象）放冷过滤（滤液留作糖的检识）。
沉淀物为芦丁苷元——槲皮素的粗品。
用甲醇重结晶（槲皮素粗品水洗至中性，加250ml加甲醇，加热，放冷静置，抽滤得晶体）。
干燥称重，得槲皮素精品。
4.糖的检识取芦丁水解后的滤液20ml。
加Ba(OH)2溶液（或固体BaCO3）中和至中性，不断搅拌下进行。
滤去白色的BaSO4沉淀。
滤液浓缩至2~3ml作纸色谱的样品溶液。
条件：对照品：鼠李糖、葡萄糖展开剂：n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液显色剂：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后在105℃加热5-10min。
5.芦丁及槲皮素的聚酰胺色谱样品：1%芦丁、槲皮素甲醇溶液对照品：芦丁、槲皮素对照品展开剂：80%乙醇显色方法：用浓氨水或1% AlCl3醇溶液显色后，日光及紫外灯下观察。
6.芦丁及苷元的定性反应A样品制备：取芦丁及槲皮素精制品少许用MeOH溶解。
B定性试验：取上述两试液1ml分别放于小试管中，按下列方法进行试验。
比较苷与苷元的反应情况。
莫氏(Molish)反应：加10% α-萘酚乙醇液1ml，振摇使之溶解，然后沿试管壁加浓硫酸约2ml，静置，观察，两液层界面变化，呈紫红色环者示分子中含糖结构。
盐酸--镁粉反应：分别滴加浓盐酸，再各加镁粉少许，溶液由黄色逐渐变红者示有黄酮类化合物存在。
三氯化铁反应：分别加三氯化铁醇溶液1~2滴，观察颜色。
三氯化铝纸片反应：2条纸片上分别滴加芦丁、槲皮素后，各加1%AlCl3乙醇溶液2滴，紫外灯下观察荧光变化。
醋酸镁纸片反应：取两张滤纸，分别滴两滴芦丁和槲皮素的甲醇溶液，然后各加1%醋酸镁甲醇溶液两滴，紫外灯下观察荧光的变化，并记录现象。
锆盐—柠檬酸反应：分别加入2%ZrOCl2甲醇溶液3~4滴，观察颜色，然后加入2%柠檬酸甲醇溶液，观察颜色。
7.芦丁的含量测定(1)对照品溶液的制备精密称取105干燥至恒重的芦丁对照品5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇25ml 溶解，蒸馏水定容至刻度，摇匀，即可。
浓度为0.2mg/ml。
(2)线性关系考察精密吸取对照品溶液0,4,8,12,16,20ml，置25ml容量瓶中，加蒸馏水至6ml，加5%亚硝酸钠1ml，摇匀，静置6min，加10%硝酸铝1ml，摇匀，静置6min，加4.3%氢氧化钠10ml，加蒸馏水至刻度，静置15min，用紫外分光光度计测定吸收度，检测波长510nm。
以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，回归方程为：C=0.073A，相关系数为0.9996.表明浓度在0.008~0.018mg/ml范围内具有良好的线性关系。
25ml容量瓶1（空白）2 3 4 5 6 7（样品）芦丁对照品0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 样品液5.0ml5%亚硝酸钠1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml10%硝酸铝1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml4.3%氢氧化钠10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml用蒸馏水稀释至刻度摇匀，静置15minA(510nm)注意事项：1．芦丁粉碎的不可过细，一面过滤时速度过慢。
2.本试验选择石灰乳调节，但pH值不能过高，否则钙能与芦丁形成螯合物而沉淀析出,pH过低会使芦丁形成（金羊）盐重新溶解，降低收率（最佳为4）3.利用芦丁在冷热水中的溶解地差别来达到重结晶的目的。
七、主要参考文献上海药物研究所：中草药有效成分的提取和分离中国医学科学院药物研究所：中草药有效成分的研究（第一分册）药学杂志（日）72:333:195279:757:195976:1210:1956黄铜体化合鉴定手册。
American pharmaceutical Journal41:585：1952中草药28：（2）：88 1997[1]国家药典委员会编中国药典[S]北京: 化学工业出版社，2010:333.[2]胡杰，邓宇.芦丁提取工艺的综述[J]中国食品添加剂，2006(5):94-99.[3]魏彩霞，谢俊峰，高媛媛等 . 槐米中芦丁的超声辅助提取工艺研究〔J〕. 制剂技术，2010，19( 7) : 36-37.[4]萨燕平,彭永芳。
超声辐射提取槐花米中的芦丁。
云南化工[J],1996,(4):25~26。
[5]唐爱莲,刘宁,程南秋. pH值对芦丁提取工艺影响及槲皮素制备工艺的研究.桂林医学院学报[J] 11994, 7 (3):29 32.[6]舒晓宏,冯梅,陈华,张宝,邓卅. 槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究[J]. 大连医科大学学报. 2005(02)八、思考题1．为什么必须热水提取？水提取多用煎煮法而不用回流提取法，为什么？2．一般提取液需经适当浓缩才可析出结晶，为什么芦丁未经浓缩就析出结晶？3．一般需经分离净化才能得到化合物粗品，为什么芦丁未经这些处理就得到了粗品？4．酸水解常用什么酸，为什么用H2SO4比用HCl水解后处理更方便。
5．为什么定性反应有的在试管中做，有的在纸片上做。
6．当反应试剂组成是2个以上时，常需考虑试剂的加入顺序，试分析盐酸一镁粉反应。
