中性蛋白酶水解核桃蛋白工艺

核桃中蛋白质的分离提纯核桃(Juglans regial L．)原产中亚，又叫胡桃、羌桃、万岁子等，系胡桃科核桃属植物。

我国栽培的核桃品种约有40 余种，各地均有分布。

核桃作为林业副产品，很有开发利用的价值。

核桃营养丰富，是世界“四大”干果之一。

据测定，每百克含蛋白质14.9 克，脂肪58.8 克，核桃中的脂肪71%为亚油酸，12%为亚麻酸，碳水化合物9.6 克，膳食纤维9.6 克，胡萝卜素30 微克，维生素E 43.21毫克，钾385 毫克，锰3.44 毫克，钙56 毫克，磷294 毫克，铁2.7 毫克，硒4.62 微克，锌2.17 毫克人。

就营养成分比较来说，核桃营养价值是大豆的8.5 倍，花生的6 倍，鸡蛋的12 倍，牛奶的25 倍，（1 斤核桃仁相当于5 斤鸡蛋或9 斤牛奶的营养价值）肉类的10 倍。

核桃仁在增进人体健康方面，是中药的重要辅料，有顺气补血，止咳化痰，润肺补肾，滋养皮肤等功能。

据有关资料记载历史上有许多老寿星和素食家也是把食用核桃作为养生美颜的主要果品。

近几年有些癌症患者，经常食用核桃，或核桃仁加工的副食品，明显有控制癌扩散的积极效能；现代医学又证明，经常食用核桃有降低血液中胆固醇和软化血管的作用。

核桃蛋白含量为14%～17%，其蛋白消化率可达87.2%。

主要由4类蛋白质构成, 即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白, 分别占核桃蛋白总量6.81%、17.57% 、5.33% 和70.11% , 核桃蛋白中的醇溶蛋白有独特的氨基酸组成, 其中支链氨基酸和中性氨基酸含量较高, 是植物蛋白中少有的特色组成,据有极高的开发利用价值。

核桃蛋白含有18种氨基酸, 其中包括8种必需氨基酸, 且精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸等含量相对较高, 接近联合国粮农组织( FAO)和世界卫生组织(WHO )规定的标准, 它是一种很好的植物蛋白。

但目前理想的核桃蛋白保健食品在市场上并不多见，可见核桃蛋白极具开发价值。

核桃蛋白的分离纯化及功能性质的研究随着现代科学技术的发展，蛋白质已经成为现代生物学研究中非常重要的研究对象，在以它们构成和性质为基础的研究和开发被广泛应用。

核桃蛋白是一类非常重要的单元蛋白，具有多种生理活性。

本文旨在研究核桃蛋白的分离纯化及其机理性质。

一、核桃蛋白结构核桃蛋白是一种植物类乳糖酶，主要由两种可溶性蛋白组成：核桃抗性蛋白（NRT）和核桃糖酶（NE）。

NRT是一种65 kDa的肌动蛋白，它通过酶解作用分解能量类外源物质和非结构性抗原来支持核桃生长。

它以其独特的结构支持它的抗性和活性。

与NRT相比，NE是一种25 kDa的核苷酸酶，它可以水解糖苷键，以便提供能量到核桃细胞。

核桃蛋白的其它功能包括抗体反应，细胞因子合成和调节细胞凋亡等。

二、核桃蛋白的分离纯化核桃蛋白的分离纯化，需要使用一系列技术，包括柱层析、电渗透和膜过滤等方法。

层析可以分离和纯化核桃蛋白，而其纯度比电渗透稍低。

膜过滤是一种高纯度分离纯化方法，它可以有效地去除杂质和其它蛋白。

当核桃蛋白经过分离和纯化后，它可以用于生物化学分析和功能性研究。

三、核桃蛋白的功能性研究核桃蛋白具有多种生理活性，因此，很多研究者都想深入了解它的生理功能。

最近的研究表明，核桃蛋白可以增强机体的抗氧化能力，对对抗内在和外在的氧化应激具有重要作用；它还可以阻断放射性物质的吸收，具有显著的辐射防护作用；它还具有显著的抗细菌活性，可以抑制致病性细菌的生长和复制。

此外，核桃蛋白还具有抗肿瘤作用，可以降低细胞癌变的风险。

四、总结本文旨在研究核桃蛋白的分离纯化及其功能性质。

核桃蛋白是一类单元蛋白，由NRT和NE两种可溶性蛋白组成，具有多种生理活性，如抗氧化能力、辐射防护作用、抗细菌活性和抗肿瘤作用等。

核桃蛋白的分离纯化，需要使用技术，如柱层析、电渗透和膜过滤等，可以有效地去除杂质和其它蛋白，并可用于生物学分析和功能性研究。

鉴于其多种功能，核桃蛋白可能在科学研究和产业应用中发挥重要作用。

核桃蛋白酶解物的制备及抗氧化活性陈宁;孙一;刘淑莹【摘要】采用碱性蛋白酶对核桃蛋白进行酶解,检测了所得酶解物的抗氧化能力,包括对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和羟基自由基(·OH)的清除能力；利用Sephadex G-25凝胶层析柱和反相柱对核桃蛋白酶解物进行分离纯化；采用液相色谱-质谱(LC-ESI-Q-TOF)联用方法测得抗氧化能力最强的多肽的序列为Ala-Gly-Gly-Ala,其还原力和还原型谷胱甘肽相当.%Many studies have reported that peptides from various food sources possess antioxidant activity. In the present study, walnut proteins were hydrolyzed using Alcalase 2. 4 L to obtain antioxidant peptides. The antioxidant activities of the hydrolysates were measured using 1, l-diphenyl-2-picryl hydrazyl ( DPPH) assay and hydroxyl radical scavenging activity( HRSA) assay. Then, walnut protein hydrolysates were purified sequentially by gel filtration and RP-HPLC. The sequence of the peptide with the highest antioxidative activity was identified to be Ala-Gly-Gly-Ala using RP-HPLC-ESI-MS, which was identified for the first time from walnut protein hydrolysates. The reducing power of the peptide was similar to that of L-glutathione reduced ( GSH). These results suggest that the peptide isolated from walnut protein hydrolysates is potent antioxidant and may be effectively used as food additives and as pharmaceutical agents.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2013(034)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】核桃蛋白水解;抗氧化;纯化;抗氧化肽【作者】陈宁;孙一;刘淑莹【作者单位】中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心,长春130022;中国科学院研究生院,北京100039;吉林省人参科学研究院,长春130117;中国科学院长春应用化学研究所,长春质谱中心,长春130022;吉林省人参科学研究院,长春130117【正文语种】中文【中图分类】O657核桃(Juglans regia L)又名胡桃，系胡桃科胡桃属植物，味甘，性温．核桃营养价值很高，日常生活中除少量新鲜食用和加工成休闲食品外，大部分用于榨油，榨油剩余的残粕中含有大量的蛋白质，但残粕的利用度却很低．核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸的含量很高［1～3］．蛋白质是人体所需的重要营养素之一，在人体内以氨基酸或肽的形式被消化吸收［4］．因此，充分利用好核桃蛋白，可提高核桃产品的附加值和竞争力．在生物体内，生物大分子的氧化是一个由自由基介导的必要的生理过程．但是过量的自由基则会给细胞带来伤害甚至死亡，导致癌症、中风、糖尿病及心肌梗塞等疾病的发生［5～11］．已有研究［12］表明，食物来源的生物活性肽具有在体内清除自由基的能力，并且比合成的抗氧化剂更安全．目前，对食物蛋白质来源的酶水解物的抗氧化性研究主要集中在大豆蛋白、小麦蛋白、鹿茸和鱼等［13～16］，而对核桃蛋白水解物抗氧化性的研究报道则较少．本文以碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)水解核桃蛋白，对获得的水解产物进行了葡聚糖凝胶柱和反相层析分离纯化，测定了水解物对DPPH和羟自由基的清除能力，探讨了核桃蛋白水解物的抗氧化活性;对抗氧化能力强的多肽采用LC-ESI-Q-TOF鉴定了其一级序列．1 实验部分1．1 材料、试剂与仪器核桃购自长春沃尔玛超市;碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L购自丹麦Novozymes公司;HPLC级乙腈购自美国Fisher公司;1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)，L-glutathione reduced(GSH)购自 Sigma公司．Waters Alliance 2695高效液相色谱系统;Waters 2996二极管阵列检测器;RRLC-Q-TOF 6520质谱仪(Agilent公司);ZORBAX Extend-C18色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×150 mm，Agilent公司);多功能酶标仪(Tecan公司)．1．2 核桃蛋白酶解物的制备与分离纯化1．2．1 核桃蛋白的制备将核桃去皮粉碎过40目筛，用石油醚脱脂2次(料液体积比1∶10);用NaOH调节pH=9.0，于45℃孵育1 h，以3500 r/min转速离心30 min，取上清液调节pH=4.5后静置，以3500 r/min转速离心30 min，将沉淀用水洗至中性，冻干即得核桃蛋白．1．2．2 核桃蛋白酶解物的制备取一定量的核桃蛋白用水溶解(质量分数3%)，用0.5 mol/L NaOH调节反应体系pH=8.0，于50℃恒温振荡反应．将50℃预热的碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)加入到反应体系中，启动酶解反应;反应过程中加入NaOH以维持反应体系的pH值．反应3 h后，于90℃水浴保持10 min，使酶失活;以3500 r/min转速离心30 min，上清液即为核桃蛋白酶解物．1．2．3 核桃蛋白酶解物的分离纯化将核桃蛋白酶解物用截留分子量(MWCO)为3000的超滤管进行超滤，超滤组分进行抗氧化实验．对核桃蛋白酶解物超滤后抗氧化强的组分进一步用Sephadex G-25凝胶层析柱分离纯化，收集各组分、冻干，进行抗氧化实验筛选．取Sephadex G-25纯化后抗氧化活性最强的组分进一步用HPLC纯化，收集各组分、冻干，进行抗氧化实验筛选．1．3 核桃蛋白酶解物的抗氧化活性研究1．3．1 DPPH清除能力(DRSA)实验参照文献［17，18］方法测定酶解物的DPPH清除能力，DPPH清除能力按下式计算:式中，As为蛋白酶解物的吸光度;Ab为样品背景的吸光度(不加DPPH);Ac为对照管的吸光度(水代替样品)．1．3．2 羟基自由基(·OH)清除能力(HRSA)实验参照文献［18，19］方法测定酶解物的羟基自由基清除能力，羟自由基清除能力按下式计算:式中，As为蛋白酶解物的吸光度;A1为损伤管的吸光度(水代替样品);A0为未损伤管的吸光度(水代替双氧水)．1．3．3 还原力的测定参照文献［19］方法，以酶解物还原三价铁为二价铁，用铁氰化钾检测二价铁，溶液在500 nm处有吸收，吸光度值与还原力成正比．1．4 核桃蛋白酶解多肽的序列鉴定将HPLC纯化后抗氧化活性最强的组分先用UPLC测定其纯度，再用LC-ESI-Q-TOF手段鉴定肽段的一级序列．UPLC条件:流动相A为超纯水［含0.1%甲酸(体积分数)］，流动相B为乙腈;梯度洗脱:5%～50%B(0～14 min);柱温30℃;流速0.3 mL/min;进样量10 μL．测序色谱条件:流动相A为超纯水［含0.1%甲酸(体积分数)］，流动相B为乙腈;梯度洗脱:5%～70%B(0～20 min)，70%B(20～25 min);柱温30℃;流速0.3mL/min;进样量10 μL．测序质谱条件:电喷雾正离子电离模式，质量扫描范围m/z 50～2000，气体温度350℃，干燥气流速9 L/min，喷雾气压0.28 MPa，毛细管电压3.5 kV，裂解电压150 V，锥孔电压65 V．利用Peaks Viewer 4.5软件(Bioinformatics Solutions Inc．)和手动计算相结合的方式鉴定多肽序列．2 结果与讨论2．1 核桃蛋白酶解物的分离与纯化利用超滤管超滤核桃蛋白酶解物后，用DPPH清除实验及羟基自由基清除实验来检测酶解物分子量分别大于和小于3000的组分的抗氧化活性．结果表明，酶解物分子量小于3000的组分具有更强的抗氧化能力，故取此组分进行下一步分离纯化．经Sephadex G-25分离纯化共获得4个主要洗脱峰F1，F2，F3和F4［图1(A)］;经抗氧化实验［图1(B)］发现F2具有更强的抗氧化活性．收集F2组分，冻干后进一步利用HPLC纯化［图2(A)］，发现F2-5抗氧化活性最强，多次收集，冻干．Fig．1 Separation of antioxidant peptides from active fraction of walnut protein hydrolysates after ultrafiltration by Sephadex G-25 gel filtration chromatography(A)and DRSA，HRSA of the eluted peaks(B)All the results are triplicates of mean±SD in(B)．Fig．2 RP-HPLC chromatography of antioxidant peptides from gel chromatography fraction 2(A)and DRSA，HRSA of the eluted peaks(B)All the results are triplicates of mean±SD in(B)．2．2 核桃蛋白酶解物的抗氧化活性DPPH自由基清除能力测定是一种常见的筛选和评价抗氧化剂活性的有效方法．DPPH是一种较为稳定的自由基，分子结构中有未成对电子，其乙醇溶液呈蓝紫色，在517 nm处有最大吸收值．当未成对电子被其它自由基电子配对后，吸收值降低，其褪色程度与所接受的电子数呈定量关系．当与抗自由基活性物质反应时，溶液颜色变浅，吸收值降低．吸收值越低表明该物质的抗自由基活性越强．羟基自由基清除力的测定选用邻二氮菲法，以H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生羟自由基，总反应可表示如下:邻二氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后，其515 nm吸收峰明显降低，根据以上原理，可以A515 nm变化反映羟自由基的氧化作用．图1(B)和图2(B)分别为核桃蛋白酶解物经过Sephadex G-25纯化后的4个组分(F1，F2，F3和F4)和组分F2经过HPLC分离纯化后各组分的DPPH和羟基自由基清除力测定结果．图1(B)显示，4个组分均具较好的DPPH和羟基自由基清除力，其中F2的抗氧化能力最强．图2(B)显示，F2-5的DPPH和羟基自由基清除力最强，收集多次冻干，分别用于测定还原力实验和多肽序列．Fig．3 Reducing power abilities of peptide F2-5，GSH and BHT used at different concentrationsAll the results are triplicates of mean±SD．图3为组分F2-5、阳性对照还原型谷胱甘肽(GSH)及二丁基羟基甲苯(BHT)的还原力实验结果．样品的抗氧化能力与还原力密切相关［14，19］，还原力越强则吸光度值越大．随着F2-5、谷胱甘肽和二丁基羟基甲苯浓度的增大，还原力逐渐增强;当F2-5浓度为1 mg/mL时还原力达到1.5，与谷胱甘肽相当，说明F2-5具有较好的还原力．2．3 核桃蛋白酶解多肽的序列鉴定将F2-5冻干样品用水溶解，先用液相色谱测定其纯度，结果显示谱图中(图4)只有1个峰，可见其为纯品;再利用液相色谱-质谱进行序列鉴定．MS/MS图谱利用专业软件Peaks的de novo功能进行分析，所得结果再手动计算确认，结果如图5所示．F2-5的氨基酸序列为 Ala-Gly-Gly-Ala．Chen等［6，20］和Sampath等［16，21］指出，活性肽中疏水性氨基酸有利于增加脂溶性，抑制油脂的氧化;甘氨酸的侧链只有1个氢原子，多肽骨架具有较高的灵活度，有利于增加多肽的抗氧化能力［22］，故本文中的活性肽也具有一定的抗氧化活性．Fig．4 RP-UPLC chromatogram of fraction F2-5Fig．5 MS/MS spectrum of the purified F2-53 结论核桃蛋白质通过碱性蛋白酶水解后得到的酶解物具有较强的抗氧化活性;经过多步分离纯化后得到多肽Ala-Gly-Gly-Ala，其还原力和谷胱甘肽相当．本文为进一步研究核桃多肽的抗氧化机理及核桃的深加工提供了一定的理论和实验依据，为核桃作为抗氧化的保健品及药品食品添加剂的开发提供了思路．参考文献【相关文献】［1］Martínez M．L．，Labuckas D．O．，Lamarque A．L．，Maestri D．M．，J．Sci．Food Agric．，2010，90(12)，1959—1967［2］ Blomhoff R．，Carlsen M．H．，Andersen L．F．，Jacobs D．R．Jr．，Br．J．Nutri．，2006，96，s52—s60［3］ Carvalho M．，Ferreira P．J．，Mendes V．S．，Silva R．，Pereira J．A．，Jerónimo C．，Silva B．M．，Food 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水解角蛋白工艺流程说明
水解角蛋白是一种重要的生物工程技术，在食品、医药和化妆
品等领域有着广泛的应用。

其工艺流程通常包括以下几个步骤：
1. 原料准备，首先需要准备角蛋白的原料，通常是从动物角质
中提取得到的。

原料的质量和纯度对最终产品的质量有着重要影响。

2. 预处理，原料角蛋白需要经过一系列的预处理步骤，例如清洗、粉碎、脱脂等，以去除杂质和提高原料的可加工性。

3. 水解反应，将经过预处理的角蛋白原料加入水解酶和适量的水，在一定的温度、pH条件下进行水解反应。

水解酶会将角蛋白分
解为较小的肽段和氨基酸。

4. 过滤和分离，水解反应结束后，需要对反应液进行过滤和分离，以去除未反应的原料残留物和水解酶。

通常采用离心、过滤等
方法进行分离。

5. 浓缩和干燥，经过分离得到的水解产物需要进行浓缩和干燥
处理，以得到成品。

通常采用膜分离、喷雾干燥等技术进行处理。

6. 成品包装，最后将水解角蛋白成品进行包装，通常采用密封包装，以保证其质量和稳定性。

需要注意的是，在整个工艺流程中，需要严格控制各个步骤的操作条件，包括温度、pH值、酶的用量等，以确保水解反应的高效进行和产物的质量稳定。

另外，对废水的处理和资源回收也是工艺流程中需要重点考虑的环节，以减少对环境的影响。

总的来说，水解角蛋白工艺流程涉及到多个环节，需要严格控制和操作，以确保最终产品的质量和安全性。

不同处理条件对核桃蛋白特性的影响不同处理条件对核桃蛋白特性的影响摘要：核桃是一种常见且营养丰富的坚果，其中的核桃蛋白是其重要的营养成分。

核桃蛋白在不同的处理条件下，如温度、酸碱、加工方法等，会发生一系列的变化，包括结构、功能和稳定性等方面。

本文将探讨不同处理条件对核桃蛋白特性的影响，并对其潜在应用进行展望。

关键词：处理条件，核桃蛋白，结构，功能，稳定性。

一、引言核桃是一种营养丰富的坚果，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等营养成分。

其中的核桃蛋白在人体生理功能、食品加工和功能性食品等领域具有广泛的应用潜力。

然而，核桃蛋白的特性受到不同处理条件的影响，因此了解这种影响对于最大化发挥核桃蛋白的功能和应用具有重要意义。

二、温度对核桃蛋白特性的影响温度是影响蛋白质结构和功能的重要因素之一。

研究表明，在不同温度下处理核桃蛋白，可以改变其构型和功能。

在低温下，核桃蛋白的溶胀性增加，其构型更加紧密。

而高温处理会导致核桃蛋白的部分失活和降解，其溶胀性和构型也会发生改变。

此外，温度还与核桃蛋白的稳定性密切相关。

在适宜的温度下处理核桃蛋白，可以增强其稳定性和抗氧化性能。

三、酸碱对核桃蛋白特性的影响酸碱条件对核桃蛋白结构和功能的影响也十分显著。

在酸性条件下，核桃蛋白的水解和降解反应会增加，导致其功能的损失。

而碱性条件下，核桃蛋白的氨基酸残基会发生脱去，使得其溶解度增加。

此外，酸碱条件还可以改变核桃蛋白的电荷分布，从而影响其亲水性和亲脂性。

四、加工方法对核桃蛋白特性的影响核桃蛋白的加工方法也会对其特性产生一定的影响。

例如，高速搅拌和超声处理可以使核桃蛋白分子更加分散，并提高其稳定性和乳化性能。

而加热处理则有助于提取核桃蛋白中的抗氧化物质，增强其抗氧化活性。

此外，不同的加工方法还能改变核桃蛋白的颗粒大小和分布情况，从而影响其稳定性和口感。

五、核桃蛋白的潜在应用了解不同处理条件对核桃蛋白特性的影响对于其潜在应用具有指导意义。