木瓜蛋白酶最适PH值和温度

利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究钟艳梅;曾宪录;郑清梅;何曼怡【摘要】为得到优质红茶饮料,利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶对红茶茶汤进行沉淀澄清研究.结果表明:两种酶均能显著提高茶汤透光率,起到澄清作用,且效果相当.木瓜蛋白酶最佳反应条件为酶添加量0.3 U/mL、作用温度50℃、作用时间45 min、pH6;α-淀粉酶最佳反应条件为酶添加量30 U/mL、作用温度45℃、作用时间15 min、pH5,但在各自最佳条件下两种酶未表现出协同作用.%The clarification effect of exogenous papain andα-amylase on black tea soup were investigated. Re-sults indicated that both two enzymes were able to significantly increase the transmittance rate, and the two en-zymes demonstrated no significant difference for clarification of tea. The optimal reaction conditions for papain were:addition amount of enzyme to be 0.3 U/mL, treatment temperature to be at 50℃, treatment time 45 min at pH 6;and the optimal conditions forα-amylase were:enzyme amount to be 30 U/mL, treatment temperat ure to be at 45℃, treatment time to be 15 min at pH 5.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)012【总页数】5页(P83-87)【关键词】木瓜蛋白酶;α-淀粉酶;红茶;澄清【作者】钟艳梅;曾宪录;郑清梅;何曼怡【作者单位】嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015;嘉应学院生命科学学院,广东梅州514015【正文语种】中文在我国茶饮料生产中，茶汤沉淀问题成为制约其市场迅速发展的主要因素[1]。

ｒ木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用研究１黄惠华何铁剑许南燕ｆ华南理工大学食品与生物工程学院，５１０６４１）摘要用木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行了酶解研究，结果表明：以大豆分离蛋白作为底物，木瓜蛋白酶的反应动力学参数妇ｌ值为０．３４％，酶的最适反应ｐＨ值为７．５，在ｐＨ争Ｏ的碱性条件下有较好的适应性。

酶的最大反应温度为６０＂（２。

在此温度条件下，温浴１８０分钟仍能保持７０％的酶活。

２．０％一２ｊ％的大豆分离蛋白溶液经木瓜蛋白酶水解后，丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、蛋氨酸等游离氨基酸含量明显增加，大豆多肽每ｌＯＯｍｌ提高９２－－９４ｍｇ，等电点分布范围变宽，由原来大豆分离蛋白的ｐＨ３．１～４．３变为ｐＨ３．１—５．５。

关键词：大豆多肽木瓜蛋白酶大豆分离蛋白ＡＳｔｕｄｙＯｉｌＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈＰａｐａｉｎｏｎＩｓｏｌａｔｅｄＳｏｙｂｅａｒｌ．ＰｒｏｔｅｉｎＨｕａｎｇＨ“ｉｈｕａＨｅＴｉｏｊｉａｎ）（ｎＮａｎｙａｎｇ（ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅａｌｓｗｉｔｈｔｈｅ坶ｄｒｏｌｙｓｉｓ０ｎｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｐ舢．Ｔｈｅｍｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｋｍｖａｌｕｅｏｆｐａｐａ／ｎｗｉｔｈｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｗａｓ３．４％．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐＨｖａｌｕｅｗａｓ６０＂ＣａｎｄｐＨ７．５．Ｐａｐａｉｎｗａｓａｄａｐｍｂｌｅｔｏｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆ６０＂（２ａｎｄｐＨ９．０．Ｐｅｐｔｉｄｅｗｅｒｅｒｅｌｅａｓｅｄｗｉｔｈｉ．ｎｅｒｃｍｅｎｔｏｆ９２·９４ｍｇ／ｌＯＯｍｌｗｈｉｌｅｔｈｅＳｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎ埘ｔｌｌ２．０－２．５％Ｗａｓｈｙｄｒｏｌｙｚｃｄｂｙｐａｐａｉｎ．Ａｎｄｔｈｅｉｓｏｅｌｅｅｔｒｉｃｐｏｉｎｔｓｏｆｔｈｅｐｅｐｔｉ幽ｓｗｅｒｅｒａｎｇｅ．ｄｆｒｏｍｐＨ３．ＩｔｏｐＨ５５ｋｅｙｎｏｒｄｓ：ｐｅｐｔｉｄｅｏｆｓｏｙｂｅａｎｐａｐａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎ１、前言大豆含有近４０％的蛋白质，开发大豆蛋白系列产品，对于充分利用我国的现有食品资源，改善我国人民的膳食结构有着重要的意义。

蛋白酶的论述摘要：蛋白酶（英语：Protease）是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。

分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。

抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。

许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。

1．木瓜蛋白酶1.1木瓜蛋白酶简介木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。

是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。

1.2木瓜蛋白酶的特点木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N末端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持99%的活性，说明木瓜蛋白酶的生物活性集中表现在C末端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。

此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。

存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。

EC3．4．22．2。

作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。

此酶主要是以内肽酶的形态起作用。

发酵工程与设备课程论文题目木瓜蛋白酶班别学号姓名成绩木瓜蛋白酶摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。

先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。

最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。

Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。

它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。

它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。

此酶主要是以内肽酶的形态起作用。

活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。

一、木瓜蛋白酶的制备及保存木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即为粗制酶，其水溶液呈混浊状，然后在通过离心去杂的上清液中加入硫酸铵,分级分离得沉淀，加入半胱氨酸溶液后经盐析重结晶干燥得精制酶，木瓜蛋白酶室温贮存活力稳定性与活力高低呈反比，正常使用时造成活力下降的主要因素为干燥失重(温度和空气氧化，粗制酶比精制酶稳定。

木瓜蛋白酶水解猪肠黏膜制备肝素水解条件的优化张秋会;徐俊涛;李苗云;高晓平;赵改名【摘要】本研究对木瓜蛋白酶水解猪小肠黏膜制备肝素的条件进行了优化,并进行了验证试验.结果表明,木瓜蛋白酶酶解条件为:温度60℃,时间3 h,料液比为1:7(g·L-1),酶底物质量分数0.80％,pH值8.8,盐浓度0.3 mol·L-1;验证试验证明该水解条件是可靠的.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2018(052)006【总页数】6页(P967-972)【关键词】肝素;木瓜蛋白酶;水解【作者】张秋会;徐俊涛;李苗云;高晓平;赵改名【作者单位】河南农业大学食品科学技术学院,河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学食品科学技术学院,河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学食品科学技术学院,河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学食品科学技术学院,河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学食品科学技术学院,河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】TQ464肝素是一种抗凝剂，具有抗凝血、抗血栓、调节血管生长等作用[1]。

临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、体外循环、血液透析等。

肝素的应用已有70多年的历史，已成为中国主要的出口药物原料之一，具有重要的经济价值[2-3]。

肝素天然存在于动物的肥大细胞中，主要以蛋白质复合物形式存在。

肝素最早发现于动物肝脏，也存在于动物的心、脾、胃、肠黏膜、肌肉和血液等中[4]，以小肠黏膜、肺脏中含量最为丰富，医用肝素主要从牛肺和猪黏膜中提取。

肝素蛋白质复合物本身没有抗凝血活性，随着蛋白质的去除，肝素的抗凝血活性才能表现出来，因此肝素的提取、纯化、精制技术已成为研究的热点[5-6]。

蛋白酶的种类1．木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。

是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。

此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。

它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

2．胃蛋白酶胃蛋白酶（英文名称：Pepsin）是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。

胃蛋白酶原由胃底主细胞分泌，在pH1.5～5.0条件下，被活化成胃蛋白酶，将蛋白质分解为胨，而且一部分被分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。

可分解蛋白质中苯丙氨酸或酪氨酸与其他氨基酸形成的肽键，产物为蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，该酶的最适pH为2左右。

3．中性蛋白酶中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。

糖化酶（EC3.2.1.3）
♦ 国内有多家企业采用黑曲霉（A.niger）液体 深层发酵法生产。产品有固体和液体两种剂 型。
♦ 该产品的酶活力10万U/ml(g),最适温度5060℃，最适作用PH4.0-5.0。
♦ 酶活力定义为在40℃，PH值4.6条件下，每1h 分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,为1个酶活力 单位。
60℃ ， 最 适 作 用 PH 值 6.0-6.5 ， 适 用 PH 值 范 围 4.87.5。 ♦ 酶活力定义为在40℃，PH值6.5条件下，每分钟水解1% 的大麦β-葡聚糖产生相当于1μmol葡萄糖的酶量为1 个β-葡聚糖酶酶活力单位。
木聚糖酶（EC3.2.1.8）
♦ 国内已有企业采用霉菌经固体发酵法生产木聚糖酶， 产品为固体剂型。亦有企业采用细菌经液体深层发酵 法生产木聚糖酶，产品有液体和固体两种剂型。
♦ 该 产 品 最 适 作 用 温 度 45-55℃ ， 适 用 温 度 范 围 3060℃，最适作用PH3.0-4.0，适用PH范围2.5-5.0。
♦ 酶活力 20000 U/ml(g)。 ♦ 酶活力定义为在温度50℃，PH3.5条件下1小时分解果
胶产生1mg还原糖（以半乳糖醛酸计）所需的酶量为1 个果胶酶活力单位。
α-淀粉酶（EC3.2.1.1）
♦ 国内有多家企业采用枯草杆菌 （B.subtilis）液体深层发酵法生产。产 品有固体和液体两种剂型。
♦ 该产品的酶活力2000U/ml(g),最适作用 PH5.0-7.0，最适作用温度60-70℃，钙离 子对酶有保护作用。
♦ 酶活力定义为在60℃，PH值6.0条件下， 每1h液化1g可溶性淀粉,为1个酶活力单 位。
♦ 添加以木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、纤 维素酶等组成的复合饲料酶制剂可以分解 NSP，降低肠内的粘度，提高了饲料利用率。 同时，由于NSP被降解还可释放植物的细胞结 构所固定的淀粉和蛋白质，可以全面增加可代 谢能量和提高蛋白质利用。

C.解旋酶、DNA聚合酶、水通道蛋白等蛋白质的新生肽链含靶向序列
D.若新生肽链不含定位信号，这些蛋白质可能停留在细胞质基质
17.超高压技术和木瓜蛋白酶广泛应用于食品工业，为探究木瓜蛋白酶在高压食品体系中的应用，某科研小组将木瓜蛋白酶溶液分别在0.1MPa（对照组）、200MPa和600MPa的压力下处理，测定其平均氢键数量（处理50纳秒（ns）的平均值）和木瓜蛋白酶相对活性变化的数据（注：氢键是稳定蛋白质空间结构的重要非共价结合力），下列说法错误的是（ ）
A.为避免杂菌污染，纤维素酶处理过的细胞要放入无菌水中
B.可以利用高Ca2+高pH融合法诱导②过程原生质体融合
C.过程③培养基需要添加营养物质、生长素和细胞分裂素等
D.该过程通过形成愈伤组织生产药物，不能体现细胞的全能性
12.某动物细胞为细胞系细胞，具有贴壁生长特性。在细胞培养过程中需要分瓶培养，一瓶细胞可分到多瓶中培养，这个分瓶数称为分瓶比。下列说法正确的是（ ）
A.作画用的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌
B.作画的培养基必须用鉴定培养基，否则无法显现颜色
C.分次接种的目的是为了形成单菌落，防止菌落重叠
D.推测3种菌生长所需pH值、氧气条件基本相同
20.稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物，对PCR扩增产物经Accl酶切后电泳。如图所示，已知引物1为5'GCTTCACTTCTCTGCTTGTG3'，Accl酶的识别位点为5'GTATAC3'，两引物之间无另外的Accl酶的识别位点。下列叙述正确的是（）

温度对木瓜蛋白酶活性的影响实验目的1.1掌握蛋白酶活性的测定方法1.2 理解酶促反应的最佳温度、酶的热稳定性1.3 了解蛋白酶的催化反应机理2实验原理酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。

酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：a.酶的主要成分是蛋白质。

b.酶促反应所需的活化能较低。

c.酶的催化效率非常高。

d.酶具有高度的专一性。

影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度、激活剂及抑制剂等。

木瓜蛋白酶属于中性蛋白酶，它的催化作用受温度的影响较大。

在最适温度下，酶的反应速度最高。

大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。

另外，酶的热稳定性也是酶性质研究的重要内容。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。

有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性，但不能使酶失活。

木瓜蛋白酶是一种具有广泛底物专一性的巯基类蛋白酶。

有很强的分解蛋白质的能力，此外还具有水解酰胺键和酯键的特性。

由于它具有适用pH范围广，热稳定性好等优点，广泛应用于食品，工业，医药生产中。

位于木瓜蛋白酶活性中心的巯基（-SH）具有很强的亲核性，一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团，极易被氧化形成二硫键（-S-S-）而导致木瓜蛋白酶失活。

3 主要仪器与药品3.1试剂：钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、浓溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、NaOH、磷酸二氢钠、酪蛋白、酪氨酸、木瓜蛋白酶福林试剂的制备：于250mL磨口回流装置中加入钨酸钠10.0g、钼酸钠2.50g、蒸馏水70.0mL、85%磷酸5.0mL、浓盐酸10.0mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷凝管，在通风橱中加入硫酸锂5.0g、蒸馏水5.0mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴。

冷却后仍有绿色，再加入数滴溴水，煮沸，冷却，加水定容至100mL。

木瓜蛋白酶的开发与应用一、本文概述木瓜蛋白酶，一种源于木瓜果实中的天然酶类，凭借其独特的催化性能和广泛的应用价值，近年来在生物科技领域引起了广泛关注。

本文旨在全面探讨木瓜蛋白酶的开发与应用，通过深入了解其生物特性、提取工艺、纯化技术等方面，以期推动木瓜蛋白酶在食品、医药、化妆品等多个领域的广泛应用。

文章将从木瓜蛋白酶的基本性质出发，详细阐述其开发过程中的关键技术和应用现状，并展望未来的发展趋势和潜在挑战。

通过本文的阐述，希望能够为相关领域的研究人员和企业提供有益的参考和启示，推动木瓜蛋白酶产业的持续发展和创新。

二、木瓜蛋白酶的开发木瓜蛋白酶，一种源自木瓜乳液的巯基蛋白酶，自被发现以来，其在多个领域的应用价值逐渐被人们所认识。

其独特的催化特性，如高效性、特异性和温和的反应条件，使得木瓜蛋白酶在食品、医药、化妆品、皮革和纺织等多个行业中都有广泛的应用。

木瓜蛋白酶的提取过程主要包括乳液的收集、离心分离、沉淀和纯化等步骤。

在提取过程中，需要注意保持酶的活性，避免在高温或酸性环境中失活。

随着技术的发展，研究者们也在不断探索更高效的提取和纯化方法，如利用超滤、离子交换层析和凝胶电泳等技术，以提高木瓜蛋白酶的纯度和活性。

对木瓜蛋白酶的酶学性质进行深入研究，是开发其应用的基础。

这包括对其最适pH值、最适温度、热稳定性、抑制剂敏感性等方面的研究。

通过深入研究，可以更准确地掌握木瓜蛋白酶的催化特性，为其在各个领域的应用提供理论依据。

随着生物技术的飞速发展，遗传工程技术在木瓜蛋白酶的开发中也发挥了重要作用。

通过基因克隆、基因表达和蛋白质工程等技术，可以实现对木瓜蛋白酶的定向改造和优化，如提高其热稳定性、拓宽其底物特异性等。

这为木瓜蛋白酶在更广泛领域的应用提供了可能。

基于木瓜蛋白酶的特性和应用需求，可以开发出一系列新产品。

例如，在食品工业中，可以利用木瓜蛋白酶制作低过敏性的食品；在医药领域，可以开发木瓜蛋白酶作为药物载体或治疗某些疾病的特效药；在化妆品行业，木瓜蛋白酶可以作为天然酶制剂用于皮肤护理等。

木瓜蛋白酶，重要的生物学植物酶：综述Ezekiel Amri and Florence Mamboya Department of Science and Laboratory Technology,Dar es Salaam Institute of Technology (DIT), P. O. Box 2958, Dar es Salaam, TanzaniaReceived 2012-05-13; Revised 2012-05-20; Accepted 2012-06-02摘要木瓜蛋白酶是一种植物蛋白水解酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶，我们对于其功能的研究已经取得了重大进展。

木瓜蛋白酶天然存在于木瓜(番木瓜番木瓜属) ，由木瓜果实的胶乳中提取。

能够分解为氨基酸，多肽等有机分子，在生理，病理，药物设计，工业用途，如肉嫩化和药物制剂等不同的生物学过程扮演重要角色。

木瓜蛋白酶的独特的结构有助于阐明蛋白水解酶的工作原理，实现一系列生物学价值。

现在研究认为，其生物学重要性，特性和结构特点对于对其生物功能的理解十分重要。

同时我们对其潜在的生产和市场价值进行了讨论。

1. 引言木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一种内源性植物半胱氨酸，它是从番木瓜中分离出的蛋白酶(番木瓜番木瓜属) 胶乳。

木瓜蛋白酶是通过切割未成熟木瓜表皮，收集并干燥从切口中流出的胶乳得到的。

在不成熟的水果中木瓜蛋白酶的活性更高。

木瓜酶属于木瓜蛋白酶超家族，作为蛋白水解酶，木瓜蛋白酶在所有活的生物体是许多重要的生物过程中至关重要的物质(黄杨等人，1999)。

木瓜蛋白酶示在蛋白，短链肽，氨基酸酯和酰胺链接中表现出广泛的蛋白水解活性，并在食品和医学领域被广泛应用(尤利格，1998 年)。

它优先切割的肽键包括碱性氨基酸，特别是精氨酸，赖氨酸和苯丙氨酸残留物(梅纳尔等人，1990年)。

木瓜蛋白酶的独特的结构有助于理解蛋白水解酶如何工作的并且达到多种生物学目的。

另一方面，由于嫩化剂比较充分的发挥作用是在肉品被
蒸煮的期间，温度较高，而木瓜蛋白酶最适合温度55～60℃， 热稳定性强，在90℃时也不会完全失活，因此常用于生产嫩 肉粉水解啤酒内的蛋白质，部分水解一些 已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒 在冷冻过程中的高清澈度，同时改善啤酒口感及原有多 肽和氨基酸的组成和比例，有效地改良啤酒品质。
木瓜蛋白酶的研究进展
一 木瓜蛋白酶的简介 二 木瓜蛋白酶的提取 三 木瓜蛋白酶的固定化 四 木瓜蛋白酶的应用 五 木瓜蛋白酶的展望
一 木瓜蛋白酶的简介
中文名称：木瓜蛋白酶，别名番木瓜酶,木瓜朊酶, 番瓜酵素,木瓜酶 英文名称：papain 定义：一种蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的 根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含 量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸， 属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、 天然卫生安全等特点
双水相萃取具有目标产物收率高、易于连续化操作、 不存在有机溶剂残留、分离过程经济等优点。
三 木瓜蛋白酶的固定化
由于木瓜蛋白酶价格昂贵且无法重复利用， 促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。固 定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸碱和有机 介质中失活，实现酶的反复利用，达到节约 生产成本的目的。常用的固定化方法有吸附 法、载体交联法和包埋法。
3.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。
金锋采用微孔淀粉-海藻酸钠包埋法固定化木瓜蛋 白酶，结果表明，最佳固定化木瓜蛋白酶制备条件为 微孔淀粉浓度4%，海藻酸钠浓度3%，CaCl2浓度5.5%。此 时固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，最适温度72℃， 其耐热性、操作稳定性、机械强度都不同程度增加， 操作成本低，适合工业推广。

壳聚糖。 1 实验材料与方法 1.1 实验仪器与试剂
PHS型数字酸度计（杭州雷磁分析仪器厂），85-1磁力 搅拌器（上海志威电器有限公司），BIO-Rad Win-IR型傅立 叶红外光谱仪（上海岛津），PL303电子天平（梅特勒-托利 多仪器有限公司），HZQ-F100恒温振荡培养箱（哈尔滨东联 电子技术开发有限公司），DZG-6050真空干燥箱（杭州卓驰 仪器有限公司），UV-1800紫外分光光度计（上海岛津）。
为4，反应时间24h。在降解反应进行到70min时加入的H2O2 可以使酶解反应后的壳聚糖得到更进一步的降解，而且能 使反应溶液的颜色变浅。因其制备成本低，反应条件温和， 加入试剂比较少，工艺简单，得到的分子量比较小，木瓜蛋 白酶-双氧水降解壳聚糖的方法具有很高的实际意义，为 低分子量壳聚糖的工业化生产提供了广阔前景。
（College of Chemical Engineering, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)
Abstract: The degradation of chitosan by papain-H2O2 was performed in this paper. The effects of temperature, pH value, the adding time of hydrogen peroxide, reaction time on the molecular weight of chitosan were analyzed, and the structures of products were characterized by FT-IR. The results showed that the optimal conditions were as followed: pH 4, the temperature of papain 45℃, the reaction temperature of hydrogen peroxide 60℃ and the reaction time 24h. Under these conditions, it was found that the decrease of molecular weight could lead to the change of lattice structure, but the chemical structure was not changed. Key words：chitosan; papain; hydrogen peroxide; degradation

摸索，对于酶工程实验的开设和指导生产实践具有良好 ４、６、７、 ８ 和 １０。
的借鉴意义。
１．２．５ 木瓜蛋白酶的固定化
1. 实验材料与方法
木瓜蛋白酶液与海藻酸钠溶液先混匀；加入明胶溶
１．１ 材料：番木瓜
液再混均；用 ６ 号注射器针头以 １５ ｃｍ 高度均匀向下注
１．２ 方法
入到氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球；冰箱放置 ３０
１．２．１ 提 取 未 成 熟 新 鲜 青 番 木 瓜， 去 皮 切 ｍｉｎ；抽滤滤出微球，置入戊二醛中硬化 １－２４ ｈ；待微球
碎，加磷酸缓冲液，过滤，取滤液离心 １５ ｍｉｎ（３５００ｒ／ 达到一定硬度后，用生理盐水洗涤，制备成固定化酶。
ｍｉｎ，４℃），取上清液弃沉淀，加入 ４５％ 乙醇，４℃静置过夜，
制作标准曲线。具体操作如下：酶反应体系 ３ ｍＬ，０．２ Ｍ ｍｉｎ 加完。由于丙酮和硫酸铵的协同作用，静置 １５ ～ ３０
不同 ｐＨ 的磷酸缓冲液（含 Ｌ－Ｃｙｓ 和 ＥＤＴＡ）１ ｍＬ，１％ ｍｉｎ 后溶液分相，上相约占总体积的 １／３，为丙酮和木瓜
酪蛋白 １．５ ｍＬ，木瓜蛋白酶 ５００ ｕＬ。以磷酸缓冲液代替 蛋白酶的混合物；下相几乎无活性，可直接弃去；
木瓜蛋白酶液作为参比对照。反应时间 １０ｍｉｎ，加入 ３．０
结晶。将上相离心，取相界面处沉淀，即为浓缩木
ｍｌ ０．８Ｍ ＴＣＡ（三氯乙酸）终止反应，震荡混匀后，室温 瓜蛋白酶。将沉淀抽真空除去丙酮后，在显微镜下观察
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104 ２０１７年第３期
农业科技
并照相。该方法参考。
应温度范围非常广，在 ４０℃ －８０℃之间都能有比较高的
１．２．６ 木瓜蛋白酶的结晶
离心 ２０ ｍｉｎ（５５００ ｒ／ｍｉｎ），取沉淀，紫外吸收法测定酶

四种液态调味料的生产加工工艺01蚝油蚝油是一种天然风味的高级调味品，是粤菜传统调味料之一，在广州和福建等地普遍食用，在港澳台地区及南洋群岛极为畅销，在国际上也享有一定声誉。

蚝油具有天然的牡蛎风味，味道鲜美，气味芬芳，营养丰富，色泽红亮鲜艳，适用于烹制各种肉类和蔬菜，调拌各种面食，也可直接佐餐食用。

1、生产设备绞肉机或钢磨、夹层锅或真空浓缩锅、带搅拌配料罐、盐酸水解罐、60～80目筛网、120目筛网或过滤机、胶体磨、洗瓶机、灌装机及压盖机。

2、工艺流程牡蛎→去壳→清洗→绞碎→煮沸→过滤→煮汁→去腥→浓缩→混合→调配→均质→杀菌→成品3、产品配方根据蚝油风味，配制了3种配方，分别见表1、表2和表3。

4、操作要点1）原料采用鲜活的牡蛎或毛蚶。

2）去壳将牡蛎或毛蚶用沸水焯一下，使其韧带收缩，两壳张开，去掉壳，或凉后去壳。

3）清洗将牡蛎肉或毛蚶肉放入容器内，加入肉重的1.5～2倍的清水，缓慢搅拌，洗除附着于蚝肉或毛蚶肉身上的泥沙及粘液，拣去碎壳，捞起控干。

4）绞碎将清洗干净的蚝肉或毛蚶肉放入绞肉机或钢磨中绞碎。

5）煮沸将绞碎的蚝肉或毛蚶肉称重，放人夹层锅中煮沸，使其保持微沸状态2.5-3h，用60—80目筛网过滤。

将过滤后的蚝肉或毛蚶肉再加5倍的水继续煮沸1.5～2h，过滤，将2次煮汁合并。

6）脱腥在煮汁中加入汁重0.5％～1％的活性炭，煮沸20～30min，去除腥味，过滤，去掉活性炭。

7）浓缩将脱腥后的煮汁用夹层锅或真空浓缩锅浓缩至水分含量低于65％，即为浓缩蚝汁或毛蚶汁。

为利于保存，防止变质，加入浓缩汁重15％左右的食盐，备用。

使用时用水稀释，按配方调配。

8）酸解将煮汁后的蚝肉或毛蚶肉称重，加入肉重的0.5倍的水和0.6倍的20％食用盐酸，在水解罐中100 ℃ 下水解8～12h。

水解后在40℃左右用碳酸钠中和pH值至5左右，加热至沸，过滤，滤液即为水解液。

在水解液中加入0.5％一1％的活性炭，煮沸10～20min，补足失去的水分，过滤。

实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。

是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。

现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。

木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。

它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。

有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。

有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。

使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。

高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。

硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

木瓜蛋白酶的固定及其作用摘要：木瓜蛋白酶[ EC 3. 4. 22. 2 ]是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域[ 1 ]。

由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。

此研究始于20世纪60年代初, 至今已有许多文献报道[ 2 ] 。

酶的固定化方法主要有：包埋法、吸附法、共价键结合法、交联法等,这些方法各有利弊[ 3 ]。

木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。

是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。

它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

一、木瓜蛋白酶的固定方法1包埋法固定包埋法:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法。

凝胶包埋法是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。

最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。

微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。

1. 1 海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶( Immobilized papain on sodium alginate - chitosan,IPSAC)海藻酸是从褐藻提取的,是甘露糖醛酸以β-1, 4键相连接的多糖类物质,它是包埋酶较为理想的载体,其固定化方法较为简单,条件温和,操作可在室温下进行,酶很少失活。