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维生素b2生物利用度实验报告一、荧光试验1、方法原理维生素B2（核黄素）具芳香环和杂环，有长共轭结构的π-→π＊跃迁，具有荧光性，在酸、碱性条件下及加入各种还原剂均会使维生素B2（核黄素）转变为无荧光的物质。
2、试剂和材料盐酸溶液：1＋2.氢氧化钠溶液：40g／L。
连二亚硫酸钠。
3、分析步骤取约0.05g实验室样品，加100mL水溶解后，溶液显淡黄绿色并有强烈的黄绿色荧光；加盐酸溶液，摇匀后，黄色即消褪，荧光亦消失。
二、紫外-可见吸收光谱鉴别1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，其紫外-可见吸收光谱中有三个吸收峰（444nm，375nm与267nm），用A444mm ／A267mm及A375mm／A267mm的比值来鉴别维生素B2（核黄素）。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
实验室样品溶液：取约0.075g实验室样品，精确至0.001g，置烧杯中，加1mL冰乙酸与75mL水，加水稀释，冷却至室温，移置500mL棕色容量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
石英池（1cm）。
4、分析步骤取实验室样品溶液扫描，点击光谱扫描，设定波长范围，测出光谱曲线，在波长444mm±1nm、375nm±1nm与267nmtlnm处有最大吸收，并测定吸光度（A），计算A375mm／A267mm的比值为0.31～0.33和A444m／A267mm的比值为0.36～0.39.5、测定结果A373/A267=0.342/1.039=0.33A445/A267=0.404/1.039=0.39三、维生素B2的测定1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，在波长444nm 处有最大吸收，将样品溶液于该波长处测定吸光度，以百分吸光系数（E／m）计算即得其质量分数。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
维生素b2片含量及含量均匀度测定方法的研究
维生素B2片含量及含量均匀度测定方法是利用酶法测定维生素B2片中维生素B2含
量及含量均匀度的一种测定方法。
通常采用UV波长292nm和AOAC法测定维生素B2片中
的维生素B2含量及含量均匀度，可用于维生素B2的质量控制和检验。
该测试方法具有较高的准确性，受试者可就地进行测定，只需使用分光光度计、标准
溶液和混合谱instrument即可处理完整批次，能有效数据传输，量程可调，自动选择批次，具有精确快速的数据处理能力，该测试方法为优质维生素B2片的质量控制提供了帮
助和支持。
本试验在pH为7.0的硫酸氢钠溶液中，将试样片重量折合为3mg，经混合后加入测定烧杯中，加入2ml硝酸氢钠50g/L的溶液，然后加入4ml硫酸十六氢羟基苯甲酰溶液，离
心后备用，再加入1ml琥珀酸钠溶液和LL微量盐晶，搅拌均匀后再离心，用淸洁的纯水
洗涤清洗1次，加入2ml洗涤液及2ml硝酸氢钠50g/L溶液，离心后备用，取滤液到新测
定烧杯中，加入2ml硝酸氢钠50g/L溶液，备用，再加入3ml硫酸十六氢羟基苯甲酰溶液，离心后得出测定结果。
实验六荧光光度法测定样品中维生素B2的含量一、目的与要求1．掌握用荧光光度法测定维生素B2的原理;2．加深对荧光光度法原理的理解;3．巩固荧光光度计的基本操作。
二、方法原理维生素B2又称核黄素，溶于水，在ω为0.05的乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。
维生素B2在一定波长光照射下产生荧光。
在稀溶液中，其荧光强度与浓度成正比，即：F = Kc故可采用标准曲线法测定维生素B2的含量。
三、仪器与试剂1．930型荧光光度计及其附件。
2．容量瓶：25 mL。
3．维生素B2标准贮备液（100 mg·L-1）：准确称取25mg维生素B2，用ω为0.05的乙酸溶解，转移至250 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，保存于冰箱中。
4．维生素B2标准工作液（0.5mg·L-l）：吸取上述贮备液0.50mL于100 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，随用随配。
5．含维生素B2的水样（自行制备）：取VB2片剂一片，用ω为0.05的乙酸溶液溶解（若有不溶杂质，过滤即可），稀释适当倍数后测量。
四、内容与步骤1．标准系列溶液的配制吸取维生素B2标准工作液0，0.50，1.00，2.00，3.00和4.00 mL，分别加入6个25 mL 容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀。
2．样品的准备吸取含维生素B2的水样5.00 mL于25 mL容量瓶中，用ω为0.05的乙酸溶液稀释至刻度，摇匀。
3．标准系列与样品溶液的测定按仪器的使用方法准备好仪器(仪器操作流程如下)。
待仪器稳定后，以360 nm或400 nm 为激发波长，以550 nm为荧光发射波长，用1 cm荧光皿及ω为0.05的乙酸溶液作参比（凋荧光强度为“0”），用标准系列溶液中最高浓度的溶液调节其荧光强度为“100”，分别测定其他标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。
实验一荧光光度分析法法测定维生素B2一、实验目的1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法。
2.熟悉荧光分光光度计（或荧光光度计）的结构和使用方法。
二、实验原理经紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。
荧光光谱能反映物质的特性。
以测量荧光强度和波长为基础上的分析方法称为荧光分光光度分析法。
对同一物质而言，在稀溶液(即A = abc <<0.05 ) 中，荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下关系：(35.1)式中φf 为荧光过程的量子效率，a 为荧光分子的吸光系数，b 为试液的吸收光程，I0为入射光的强度。
当I0及b 不变时，上式为F=Kc (35.2)式中K 为常数。
因此在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。
在430~440 nm 蓝光照射下，维生素B2 就会发生绿色荧光，荧光峰值波长为535 nm。
在pH = 6~7 的溶液中其荧光最强，在pH = 11 时其荧光消失。
三、仪器及试剂1、仪器：国产930型（或其它型号）荧光光度计；容量瓶（50 mL，6 个）；吸量管（5 mL ，1支）；棕色试剂瓶（500 mL）；洗瓶（500 mL）；冰箱（1台）2、试剂：（除特别注明，所有试剂均为分析纯）(1) 100.0mg·mL-1 维生素B2 标准贮备液准确称取0.1000g维生素B2，将其溶解于少量的1 %的乙酸中，转移至1 L容量瓶中，用1 %的乙酸稀释至刻度，摇匀(2) 5.00 mg·mL-1维生素B2 工作标准溶液准确移取50.00 mL 100.0mg/L维生素B2标准贮备液于1 L 容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀(3)待测液取市售维生素B2一片，用1 %乙酸溶解，在1 L 容量瓶中定容。
（注意：以上溶液均应装于棕色试剂瓶中，置于冰箱冷藏保存）四、实验步骤1.系列标准溶液配制取五个干净的50 mL容量瓶，分别加入1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL 及5.00 mL维生素B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀。
实验五 荧光光度法测定维生素B 2的含量一、实验目的1、学习荧光分光光度法测定维生素B 2的分析原理；2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B 2的方法。
二、实验原理1.荧光光度法原理（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c 有以下的关系：bc I I F εφ0303.2=当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：Kc I F =这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
（2）荧光分析法的特点：a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。
b. 选择性好。
荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c. 所需试样量少、操作方法简便。
（3）荧光光谱激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。
激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
（4）荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：H HOHOHOHNH H H OHN C NHN OH3CH3C维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。
荧光光度分析法测定维生素B2的含量引言荧光分光光度法简介有些物质，当用紫外光照射时，它吸收某种波长之后还会发射出各种颜色和强度不同的光；而当紫外光停止照射后，这种光线也随之消失，这种光线称为荧光。
荧光的波长比吸收的紫外光波长要长。
由于物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。
利用物质的这个特性，可以对物质进行定性分析。
同一种分子结构的物质，用同一种波长的紫外光照射，可发射相同波长的荧光；若该物质的浓度不同，所发射的荧光强度也不同，利用这个性质可以对物质进行定量分析。
这种定量方法称为荧光分析法，简称荧光法。
测量荧光的仪器有滤光片荧光计，滤光片―单色器荧光计和荧光分光光度计。
荧光法的选择性好，灵敏度比紫外-可见分光光度法高2~3数量级，检出限低，可以达到10~12g／m1，线性范围宽。
现在主要应用的是荧光分光光度计。
【实验目的】1. 学习荧光光度法测定维生素B2的含量的基本原理和方法。
2. 熟悉荧光光度计的结构及使用方法。
【实验原理】在经过紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c有以下关系：IF?2.303?I0?bc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：IF?Kc这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。
荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。
同时，提高仪器灵敏度，可提高荧光光度法的灵敏度。
而吸收光度法，无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。
因此，荧光光度法比吸收光度法灵敏度高。
VB2(即核黄素)在430～440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535nm。
VB2的荧光强度在pH6～7时，在pH=11时基本消失。
维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：VB2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量维生素B2（核黄素）是一种黄色的水溶性维生素，参与人体多种代谢过程，如能量代谢、蛋白质合成及细胞呼吸等。
因此，对维生素B2的含量进行精确测量至关重要。
本文将介绍一种常用的荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法。
一、测定原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收光谱和荧光光谱的仪器分析法，它利用物质在受激光或外界光源激发下，发生荧光的特性来测定物质的含量。
维生素B2在紫外光530.0nm 处吸收，同时能在pH8.0的碳酸氢钠缓冲溶液中产生荧光。
因此，荧光分光光度法可以通过测定维生素B2产生的荧光强度来计算其含量。
二、测定步骤1.准备样品将要测定的维生素B2溶于50mL的碳酸氢钠缓冲液中，并将其均匀混合。
用已知浓度的维生素B2标准品分别配制成不同浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。
2.测定荧光光谱取适量的样品及标准溶液分别装入荧光分光光度计的比色皿中，然后在含有Excitation (Ex)波长为450.0nm、Emission (Em)波长为530.0nm的荧光滤光片下进行测量。
将标样及待测样荧光强度值分别记录下来。
3.制定标准曲线将已知浓度的维生素B2标准溶液按照步骤2测定，绘制标准曲线，根据数据进行回归分析，得出求出待测样品浓度的公式。
4.检测待测样品按照步骤2进行待测样品的测定，利用标准曲线计算出待测样品中维生素B2的含量。
三、测定注意点1.样品配制时要保持一定浓度，过高或过低都会影响分析结果；2.样品制备、实验条件及荧光光度计的使用必须保证一致性；3.测量结果可受色、浑浊等因素影响，需要有一定的操作经验、严守操作规程。
四、结论本文介绍了荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法，并简要说明了测定原理及详细的操作步骤。
此种方法具有测量简便、操作方便、灵敏度高等优点，被广泛应用于维生素B2含量的测量。
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
目的：规范维生素B片检验操作，保证检验结果的准确值。
2片的中间产品、成品。
范围：维生素B2责任：质检员规定：1性状取供试品10片铺于洁净白纸上，观察其色泽及片型厚薄的均一性2鉴别1mg），加水100ml振摇，浸渍数分钟，取本品的细粉适量（约相当于维生素B2滤过，滤液照维生素B项下的鉴别（1）项试验，观察反应现象。
23检查3.1 溶出度避光操作。
取本品，照溶出度测定法（附录XC第一法），以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml加水至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照分光光度法（录IV A），在444nm的波长处测定吸收度，按C17H20N4O6的吸收系数（（E1%1cm）为323计算出每片的溶出量。
A×10×S计算公式：溶出量=E1%1cm×BA为供试品的吸收度B为供试品规格（mg）S为供试品稀释倍数维生素B2片检验标准操作程序第2页3.2重量差异按“重量差异检查操作程序”检验。
3.3水分用水分测定仪测定(颗粒)。
3.4微生物限度按“微生物检验操作程序”检验。
4含量测定4.1避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素B10mg），置1000ml量瓶中，加冰醋酸5ml与水100 ml，置水浴上加热1小2溶解，加水稀释，放冷后，4%氢氧化钠溶液30ml，并时，并时时振摇使维生素B2用水稀释至刻度，摇匀，滤过；取续滤液，照分光光度法（附录IVB），在444nm的波长处测定吸收度，按C17H20N4O6的吸收系数（E1%1cm）为323计算，即得。
4.2计算公式：A×稀释倍数×平均片重含量%= ×100%E1%1cm×W×标示量式中：A为供试品的吸收度E1%1cm为C17H20N4O6的吸收系数W为取样量（g）。
维生素b2片含量及含量均匀度测定方法的研究近年来，由于维生素B2的重要性，关于维生素B2片含量及含量均匀度测定方法的研究受到了广大研究者的广泛关注。
以维生素B2
片为例，通过研究维生素B2片的含量及含量均匀度，可以评价其产
品质量，提高其生产和使用的安全性和质量保障水平。
本文的主要内容是研究维生素B2片含量及含量均匀度测定方法。
首先，本文探讨了维生素B2片含量及含量均匀度测定方法的原理，并结合有关维生素B2片研究成果，采用实验方法来检测含量和
均匀度。
实验方法包括，用色谱仪测定维生素B2片的含量，用扫描
电镜法测定晶型，用热分析测定吸水性，用气相色谱法检测成份特点，用X射线衍射分析仪测定晶体结构，用平板扩散仪分析含量均匀度等。
其次，本文对维生素B2片含量及含量均匀度测定方法进行了深
入的研究，并对实验结果进行了讨论和分析。
根据测定结果，维生素B2片含量达到99.6%，维生素B2片的浓度分布均匀性为0.01，具有良好的含量及含量均匀度。
最后，本文总结了研究成果，给出了一种简单、准确、高效的维生素B2片含量及含量均匀度测定方法，以及维生素B2片含量及含量均匀度评价指标，为维生素B2片质量检测提供了有效依据。
综上所述，本文研究了维生素B2片含量及含量均匀度测定方法，提出了一种新的测定方法，为维生素B2片质量检测提供了有效依据。
未来，将继续深入探索维生素B2片的生产、使用过程中的含量及含
量均匀度的评价指标，以提高维生素B2片的安全性和质量保障水平。
荧光分光光度法测定维生素B2的含量实验报告——应用化学（环境检测与分析）一、实验目的1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
二、实验原理1什么是荧光？荧光是光致发光。
当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射的光。
23 荧光与环境因素的关系取代基的性质、溶剂的极性、体系的pH和温度。
维生素B2(Vitamin B2)，别名：核黄素(Riboflavin，RF)，是橘黄色无臭的针状结晶,分子式：C 17H20N4O6，相对分子量为：376.37。
因其色黄且含有核糖醇，故称为核黄素。
结构式为：由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430—440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。
维生素B2在pH＝6—7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F＝2.303ФI0εbc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc这是荧光光语法定量分析的依据。
三、仪器与试剂1、主要仪器：荧光分光光度计（日立F—7000）；比色皿：1cm；容量瓶：50mL；移液管：5mL。
2、试剂：核黄素；维生素B2药片四、实验步骤1. 溶液的配制标准溶液的配制：精确称取2 mg核黄素(VB2)，用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容待测液的配制：将维生素B2药片研磨成粉末状，精确称取2mg，用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容；2. 扫描激发光谱和荧光光谱3. 标准曲线的绘制在室温条件下，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0标准溶液于50ml棕色容量瓶中定容。
维生素b2片含量及含量均匀度测定方法的研究近年来，随着生物技术的发展，维生素B2片成为一种渐渐流行的保健品，它也被广泛应用于临床诊断和治疗。
因此，测定维生素B2片中含量及含量均匀度变得尤为重要。
本文的目的是探讨维生素B2片中含量及含量均匀度的测定方法，建立一种高灵敏度、高精度的方法。
首先，在确定研究的样品类型时，我们使用市售维生素B2片进行研究。
为了确保研究的准确性，我们选择了10批维生素B2片，每批3克，每批预先称取维生素B2片，然后进行维生素B2片的抽提分离，分别抽取每批维生素B2片进行抽提、离子交换和回收维生素B2片及其他任何可能存在的维生素类物质。
接下来，我们使用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）测定抽提后的样品中维生素B2的平均含量，以及样品中维生素B2的含量均匀度。
此外，在测定维生素B2片中维生素B2含量及含量均匀度时，我们为了确保研究的准确性，我们使用重复测定方法，以及抽样测定和偏差测定方法。
重复测定法是在同一批样品中，对同一样品进行三次以上重复测定，并计算重复测定法的精密度。
抽样测定法是在同一批样品中，将样品分成若干份，然后用抽样法测定每份样品的含量，并计算样本的精密度。
偏差测定法是在同一批样品中，测定样品的比率及其他相关参数的偏差，以检查样品的质量。
实验结果表明，我们研究的样品中维生素B2的平均含量为15.21 mg/g，并且维生素B2的含量均匀度满足质量要求，其重复测定法精密度达到RSD<3.00，抽样测定法精密度达到RSD<2.00，偏差测定法精密度达到RSD<1.00。
因此，我们建立的这种测定方法可以有效地表征维生素B2片中含量及含量均匀度，在研究及应用中具有较高的精度和灵敏度。
综上所述，本文探讨了维生素B2片中含量及含量均匀度的测定方法，建立了一种高灵敏度、高精度的方法，检验实验表明，这种方法在研究及应用中具有较高的精度和灵敏度。
此外，在未来可能还可以将此类技术应用于其他维生素片中含量及含量均匀度的测定方法，有助于更准确地表征维生素片的质量，为临床诊断和治疗提供可靠的依据。
实验四荧光分光光度法测定维生素B2一、实验目的1．了解F 96 荧光分光光度计的性能及操作。
2．掌握荧光分析法的基本原理。
3．学习荧光分析法测定维生素B2 的含量。
二、实验原理维生素B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。
其水溶液在pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为λex= 465 nm ，最大发射波长为λem = 520 nm。
在低浓度时，λex = 465 nm 时在520 nm 处测得的荧光强度与维生素B2 成正比。
即：I F＝Kc采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素B2 含量。
当pH 在11以上时，荧光猝灭。
图 4 维生素B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）三、仪器与试剂1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。
2．试剂：1％HAc 溶液；维生素B2；复合维生素片剂。
四、实验步骤1．维生素B2 标准溶液的配制称取10.0 mg 维生素B2，先溶解于少量1％HAc中，然后转移至 1 000 mL容量瓶中，用1％HAc稀释至刻度，摇匀，即配制成10.0 μg/mL的维生素B2 标准溶液。
溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。
2．标准系列溶液的配制取5个50 mL的容量瓶，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，待测。
3．未知样品溶液的配制取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以1％HAc溶解，转移至50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。
4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于F96 荧光分光光度计上，选择合适的激发波长和测定波长，测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素B2 的含量。
五、数据处理1．由记录仪记录所得荧光光谱图上查出标准系列不同浓度维生素B2 相应的荧光强度，作工作曲线。
2．在荧光光谱图上查出未知样品的荧光强度，在工作曲线上查出对应浓度，进行换算后求出片剂中维生素B2 的含量。
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.025倍的色谱峰忽略不计。
4.工艺处方组成5、仪器基本情况：6.相关术语：6.1准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。
一般用回收率（%）表示。
回收率限度应在98%～102%之间。
6.2精密度系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
6.3线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈比例关系的程度6.4范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。
6.5检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。
6.6耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
二.验证目的通过验证以确认所采用的方法适合于维生素B2片的测定。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行维生素B2片检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
三.验证依据中国药典2015年版二部中国药典2015年版四部9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》四.参考文件1、验证管理规程2、验证总计划3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程4 UV-1800紫外可见分光光度计操作维护保养规程5、中国药典2015年版6、变更控制规程7、偏差控制规程XXXX五.验证步骤1. 维生素B2片含量分析方法验证1.1系统适应性试验1.1.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)④流速：1.0mL/min。
⑤柱温：30℃⑥进样量：20μL。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。
溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，1.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。
1.1.4判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2维生素B2片含量分析方法线性验证1.2.1溶液配制1.2.1流动相配制0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相1.2.2处方量辅料配制精密称定淀粉约307mg、糊精约240mg、硬脂酸镁约3mg、混合。
此混合辅料约为10片维生素B2（50mg）所需的辅料共约550 mg。
1.2.3样品溶液配制精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg /ml的溶液。
按80%、90%、100%、110%、120%的倍数稀释，精密量取8ml、9ml、10ml、11ml、12ml分别置50ml容量瓶中，加水配置成浓度为16µg /ml、18µg /ml、20µg/ml、22µg /ml、24µg /ml的溶液。
1.2.2测定精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
按外标法以峰面积计算。
1.2.3判定标准：维生素B2在16µg /ml至24µg /ml的浓度范围内，维生素B2峰面积成线性且相关系数R≥99.8%。
1.3维生素B2片含量分析方法精密度验证1.3.1流动相配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.3.2样品溶液配制取维生素B2片20片（XXXX生产），精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B2 10mg）置500ml量瓶中，盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg /ml的溶液,取续滤液作为样品溶液。
1.3.3 测定精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6次，得到维生素B2峰面积，计算维生素B2峰的S rel。
1.3.4判定标准：维生素B2峰面积的S rel≤2.0%。
1.4维生素B2片含量分析方法准确度验证1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.4.2样品溶液配制精密称定维生素B2对照品约25mg，置250ml容量瓶中，加入处方量混合辅料275mg，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，制成浓度为100µg /ml的溶液。
按80%、100% 、120%的倍数稀释,精密量取续滤液8ml、10ml、12ml，分别置于50ml容量瓶中，加水配制成浓度为16µg /ml、20µg /ml、24µg /ml的测试溶液。
1.4.3测定精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B2峰面积。
通过线性方程计算维生素B2浓度。
用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。
1.4.4判定标准：回收率限度应在98%-102%之间，回收率的S rel≤2.0%。
1.5维生素B2片含量分析方法范围验证1.5.1数据记录及结果计算依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法符合《中国药典》2015版维生素B2峰含量的范围一般为测定浓度的范围。
1.5.2判定标准：含量的范围一般为测定浓度的 80%〜120%。
1.6维生素B2片含量分析方法专属性验证1.6.1流动相配制、溶剂Ⅰ配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。
1.6.2溶液配制1.6.2.1供试品溶液：取维生素B2片（XXXX生产）20片，精密称定，计算平均片重，研细，精密称取样品（约相当于维生素B2 10mg），置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过制成20µg /ml 的溶液,取续滤液作为供试品溶液。
1.6.2.2对照品溶液：精密称取维生素B2对照品10mg，置500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,制成20µg /ml的对照品溶液。
1.6.2.3空白溶液：在500ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇，再加水稀释至刻度，摇匀,作为空白溶液。
1.6.2.4阴性溶液：按照片剂配方，加入处方量混合辅料55mg，置250ml量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml），加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀,滤过,续滤液，作为阴性溶液。
1.6.3测定精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶液、阴性溶液各20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
1.6.4判定标准：维生素B2对照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致，空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。
1.7维生素B2片含量分析方法耐用性验证1.7.1改变流动相比例1.7.1.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(80∶15∶5)为流动相④流速：1.0mL/min。
⑤柱温：30℃⑥进样量：20μL。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.7.1.2系统适用性试验溶液：系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg，置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（(1→2)10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。
溶解并稀释制成每1ml中各约含20µg的溶液，1.7.1.3取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪。
1.7.2改变柱温及流动相1.7.2.1色谱条件①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；②检测器：紫外检测器，检测波长444nm；③流动相：0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相④流速：1.0mL/min。
