小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一)

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两种方法检测胚胎小鼠内皮型一氧化氮合酶结果的相关性分析

（图分类号］Ｒ２．１中３２时应用免疫印迹法及流式细胞仪法对胚胎小鼠肾脏内皮型一氧化氮合酶（ＮＯＳ的蛋ｅ）
白含量进行检测，旨在探讨两种方法检测结果之间是否有相关性。
两种方法检测胚胎小鼠内皮型一氧化氮合酶结果的相关性分析
包翠芬刘霞王晓梅穆长征
（辽宁医学院科学实验中心，组织胚胎学教研室，第一临床学院，锦州１１Ｏ）２Ｏ１
（关键词］小鼠；肾；内皮型一氧化氮合酶；流式细胞仪
材料和方法
裂解液加入电泳胶样品槽，１０电压下电泳，待０Ｖ样品到达合适位置，停止电泳，将胶板取下，转膜液洗涤１－０ｎ０３ｍｉ。将胶与０４／ＰＤＦ膜（．５ｍＶ￣用前置于甲醇内浸透５ｎ左右，再放人转膜液中至少ｍｉ５ｎｍｉ）置于厚滤纸（已用转膜液浸泡）之间，赶尽气泡，常温下半干转印，转印完成后将ＰＶＤＦ膜用ＴＢＴ（Ｓ１Ｔｕｅ２ＳＴＢ－％ｅｎ０溶液）冲洗，５％脱脂奶粉溶液室温封闭１２。与一抗（抗小鼠 —ｈ兔ｅＮＯＳ抗体，稀释度为１：４０４孵育过夜，０） ℃ ＴＢＴ洗脱３次，每次至少５ｎ再与二抗（性Ｓｍｉ；碱磷酸酶标记的羊抗兔ＩＧ抗体，稀释度为１：２０ｇ０）室温孵育ｌ，ＴＢＴ溶液洗脱３次，每次至少ｈＳ５ｎｍｉ；ＮＢ／ＣＰ显色；扫描电泳条带输入电脑，ＴＢＩ

内皮型一氧化氮合酶在胚胎小鼠肾脏发育中的表达

维普资讯
第１７卷第２期２００８年４月
中国组织化学与细胞化学杂志
ＣＨＩＩＥＯＵＲＮＡＬＥＳＪＯＦ删ＨｍＭ１ＡＮＤＹ
Ｖ０．７Ｎｏ２１１．．Ａｐ．０８ｒ２０
胚胎小鼠肾脏早期发育中的意义。方法
新生组（ｏＰ）小鼠各１，共６组。分别用免疫组化及免疫印迹方法对小鼠肾脏内ｅＯ只ＮＯＳ达进行定性、定量分析。结果表（）免疫组化结果显示：Ｅ４１ｌ、Ｅｌ组ｅＯＳ在生肾区呈阳性表达；Ｅ６组生肾区表达减弱，肾近端小管呈强阳性表达，５Ｎｌ同时远端小管及肾脏小动脉内皮也有阳性表达；Ｅ８组、Ｐｌｏ组近端小管呈强阳性表达，远端小管呈阳性表达，髓质中的集合管ｅＯＳ表达弱阳性，而致密斑呈阴性表达。（）免疫印迹结果显示：Ｅｌ组肾脏ｅＯＳ含量较少，随后逐渐增多，ＰＮ２４ＮＤ０组ｅＳ含量最多。结论ＮＯ（）ｅ１ＮＯＳ在小鼠肾脏第１ｄ开始呈阳性表达，以后含量逐渐升高，出生时含量最高。（）４２ｅＳ表达部位从生肾区开始，以后其表达逐渐减弱甚至消失，而肾近端小管、远端小管的表达晚于生肾区，且呈逐渐增ＮＯ
ｍａｕｕｅａ６ｔｔｅｓｍｅｔｍｅ，ｔｅｅｗａａｎｘｒｓｉｎｉｈｉｔｌｔｂｌｎａｃｌｒａｌｔｂｌｔＥ１；ａｈａｉｈｒｓａｆｉｔｅｐｅｓｏｎｔｅｄｓａｕｕｅａｄｖｓｕａｎｔｅｉｌｅ１ＡｔＥ１ｈｌｌａｃ．８，ｅＯＳｗａｌａｌｘｒｓｅｎｐｏｉｌｎｉｔｌｔｂｌｓＡａｘｒｓｉｎｏＮｓｃｅｒｙｅｐｅｓｄｉｒｘｍａ，ａｄｄｓａｕｕｅ．ｗｅｋｅｐｅｓｏｆ

一氧化氮及一氧化氮合酶在慢性肾脏病中的研究进展

【摘要】研究发现在慢性肾脏病早期一氧化氮及一氧化氮合酶表现出异常，可能与慢性肾脏病有着密切的关这
臧强张东亮刘文虎（首都医科大学附属北京友谊医院肾内科
系。文章综述了近些年来对于一氧化氮及一氧化氮合酶在慢性肾脏病中的研究进一
肾脏病的早期，出现氧化应激，即同时随着肾脏疾病的
氧化应激逐渐扩大。氧化氮（ｉｉｏｉ，Ｏ是在一氧化氮合酶（ｉ进展，ｎｒｘｅＮ）ｔｃｄｎ．在Ｏｅ等的研究中，ｂｒｇ测定６０例３５期的ＣＤ — Ｋｔｃｘｅｙｔｓ，Ｏ作用下，ｉｏｄｓｈｅｒｉｎａＮＳ）由精氨酸脱氨基而产ｃ一生，易通过弥散出入质膜，直接进入相邻的细胞，在局部患者氧化应激的标记物和急性期炎症因子（反应蛋白，白介素一）并设置正常人为对照组，６，通过队列研发挥作用，属细胞内信使，在平滑肌松弛、感觉传人中发对其进行分析。同时他还对比了氧化应激标志物及挥作用，能促使心血管扩张。ＮＳ是一种同工酶，Ｏ目前究，Ｆ所已发现的ＮＳＯ共有３种，包括神经元型一氧化氮合酶急性炎症因子同ＧＲ的关系。其研究发现，有氧化Ｋ（ｅｒｎｌｉｉｏｉｅｓｎｈｓ，ＮＳ、ｎｕｏａｎｔｃｘｔａｅｎＯ）内皮型一氧化氮应激的标志物和所有炎症因子在ＣＤ患者和健康人中ｒｄｙ有着明显的不同，但是在与ＧＲ的关系上并无明显的Ｆ合酶（ｎｏｅａｎｒｘｅｙｔｓ，ＮＳ以及在损伤ｅｄｔｌｉｉｏｉｎａｅＯ）ｈｉｔｃｄｓｈｅｌｃｒａａｕｒｄｅｓｏｙｃａｓｅ后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶（ｄｃｌｎｒＸ差异。伴有冠状动脉疾病（ｏｎｒｖｓｌｉａ，ｉｕｉｅｉｃＯ— ｎｂｔｉＣＤ和不服用血管紧张素Ｉ受体拮抗剂的患者，Ｖ）Ｉｃ一ｉｅｓｎｈｓ，Ｏ）ｄｙｔａｅｉＳ。有研究表明在ＣＤ的动物模型以ＮＫＬ一在伴有ＣＤ的患者和服用Ｖ及病患体内ＮＯ以及ＮＳＯ含量减少，本文就ＮＯ及ＮＳ反应蛋白升高明显。Ｉ６Ｏ降脂药物的患者中也有明显的差异。氧化应激的标记在ＣＤ中的研究进展作一综述。Ｋ物的含量在伴有糖尿病以及高脂血症的患者中同服用１慢性肾脏病中ＮＯ的缺乏降脂药物的患者也有明显的差异，前者表现明显升高。内源性ＮＯ几乎在每个器官系统都起着生理与病这些结果表明，ＫＣＤ患者氧化应激的标记物和急性期炎理作用，这从ＮＯ合成调节的多样性和复杂性中，不难症因子明显要高于正常对照组，但是其含量却和ＧＲＦ有一个准确的理解。诸多的因素通过ＮＳ代谢的不同Ｏ关系不大。在慢性肾脏病的早期，即出现氧化应激，同环节，影响ＮＳ的含量与活性，Ｏ从而实现对ＮＯ合成的时随着肾脏疾病的进展，氧化应激逐渐扩大。调节。合理地使用ＮＳ抑制剂或促进剂，Ｏ可能有助于在Ｊｉｓａｍｅ等的研究中，观察了肾小球内皮细胞在临床防治诸多病理过程。机体的很多部位都可以产生高糖（２５ｍｏＬ，２．ｍｌ）血管紧张素Ｉ（Ｏ～ｏＬ，／Ｉ１７ｍｌ）游／Ｎ，Ｏ而其所产生的部位决定了它的生理学功能，ＣＤ在Ｋ离脂肪酸（０ｍｌＬ培养下ｅＯ８０ｉｏ）￣／ＮＳ和活性氧自由基或者ＥＲＳＤ患者中，内皮细胞功能紊乱常常出现在疾病的关系。他们发现高糖可引起ｅＯＮＳ的功能异常同时通讯作者：刘文虎，Ｅ—ｍｉ：ｌｗ２０＠ｙｈｏｃａｉｈ０２ａｏ．ｎｌｕ也可以引起活化的氧自由基升高，同样的血管紧张素ＩＩ

小鼠一氧化氮合成酶(NOS)说明书

小鼠小鼠一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶(NOS)(NOS)(NOS)酶联免疫酶联免疫酶联免疫分析分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围检测范围：： 96T1µmol/L - 32µmol/L使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。

用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。

TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。

试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（64µmol/L ） 0.5ml ×1瓶3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。

操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析

中的意义。
１材料和方法
品孔，ＯＶ电压下电泳，ｌＯ待指示剂达到分离胶时，电压增至将
２Ｏ直到指示剂达到胶的底部。将胶板取下，转移缓冲液ＯＶ，在
１１实验动物．
中洗涤１ｍｉ，０ｎ将胶与０４／．５ｍ硝酸纤维素膜置于滤纸与海绵ｚ之间，赶尽气泡，常温下，半干转印。至转印好的硝酸纤维素膜，ＳＴｒ盐缓冲液）ＴＢ（ｉｓ冲洗２，脱脂奶粉溶液室温封闭遍５４ ℃过夜，分别与一抗（兔抗鼠ｎＳ多克隆抗体）稀释度为ＮＯ（１４０，℃孵育过夜，ＢＴ（Ｂ－．Ｔｗｅ－０溶液）：０）４ＴＳＴＳＯ５ｅｎ２洗脱３次，与二抗一再ＨＲＰ标迹的羊抗兔ＩＧ抗体（释度为１ｇ稀：２０室温孵育１，ＴＢＴ溶液洗脱３次后与ＤＢ试剂显０）ｈ以ＳＡ色，扫描电泳条带，Ｂｎｅｄｒ用ａｄＬａｅ软件分析电泳条带光密度。１５统计学分析．应用ＳＳ１．统计软件包进行统计分析，有数据均以ＰＳ１５所均数 ±标准差（ ±ｓ形式表示，ｚ）采用双因素方差分析和ｇ检
冷冻待用的左肾组织，加入３倍体积的细胞裂解液， ℃下剪Ｏ碎、匀浆，将组织匀浆液静止３ｍｉ，０ｎ冷冻离心机（Ｏ０ｒｍｉ）１００／ｎ离心１ｍｉ，１上清液，Ｂａｆｒ０ｎ取５１用ｒｄｏｄ法测定蛋白含量后，分装成每离心管中含ｌｐＯｔ白，ｏＣｇ蛋一２￣保存备用。配置８ＤＳＳ聚丙烯酰胺分离胶和５的浓缩胶，ｌｐ取Ｏｔｇ肾组织蛋白细胞裂解上清液，入１＞Ｄ加０１ＳＳ样品缓冲液，

神经元型一氧化氮合酶对小鼠心肌缺血后适应保护作用的影响

ＥＤＰ和一ｄＰ／ｄｔｍａｘ降低；与ＩＰｏｓｔＣ组比较，ＩＰｏｓｔＣ＋７一ＮＩ组的ＬＶＤＰ和＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ降低，ＬＶＥＤＰ和一ｄＰ／ｄｔｍａｘ升高。②与Ｌ／
Ｒ组比较，ＩＰｏｓｔＣ组和Ｉ／Ｒ＋７－ＮＩ组心肌梗死面积减小；与ＩＰｏｓｔＣ组比较，ＩＰｏｓｔＣ＋７．ＮＩ组梗死面积增大。③ ＩＰｏｓｔＣ组和Ｉ／Ｒ＋７一ＮＩ组心肌细胞损伤较轻；Ｉ／Ｒ组和ＩＰｏｓｔＣ＋７－ＮＩ组心肌细胞损伤明显。结论
用，ｎＮＯＳ可能参与缺血后适应心肌保护作用的调节。
缺血后适应对缺血再灌注心肌有保护作
关键词：缺血后适应；缺血再灌注；神经元型一氧化氮合酶；心肌缺血
中图分类号：Ｒ３６４．１２文献标志码：Ａ文章编号：１００７— ６６１１（２０１０பைடு நூலகம்）０１— ０ＯＯ４— ０４
ｎＮＯＳ抑制剂７一硝基吲唑（Ｉ／Ｒ＋７・ＮＩ）组、缺血后适应（ＩＰｏｓｔＣ）组和缺血后适应＋７一ＮＩ（ＩＰｏｓｔＣ＋７一ＮＩ）组。每组小鼠心脏离体
连接到Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ灌注系统进行逆行灌注，建立缺血再灌注模型，并测定血流动力学指标和心肌梗死面积，ＨＥ染色观察心肌细胞结构。结果 ①与Ｉ／Ｒ组比较，ＩＰｏｓｔＣ组的ＬＶＤＰ和＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ升高，ＬＶＥＤＰ和一ｄＰ／ｄｔｍａｘ降低；Ｉ／Ｒ＋７一ＮＩ组的ＬＶ —

小鼠肾脏发育中iNOS及iNOSmRNA的表达

维普资讯
临床
研
究
ＣＩ０ＥＮＥｌＬＨＡＲｌＤＡＮＦＧＭｃ
匿固
小鼠肾脏发育中ｉＮＯＳ及ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达 ①
史慧穆长征
（宁医学院组胚教研室锦州１１Ｑ）１２０
义。
２结果２１ｉＯｍＲ．ＮＳＮＡ在肾组织中的分布
电泳条带吸光度。
ｌｌ
ｌ
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组别
图１小鼠不同发育阶段肾脏总ｉＯＮＳ光密度百分数直条图
（）３统计学分析：￣ＰＳ．软件，采ＪＳＳ１０１采用单因素方差分析和重复测量设计的方差分析进行统计学分析。以Ｐ００为差异有显著意＜．５
【献标识码】Ａ文
【文章编号】１７－７２２０）５ｂ－０１－０６４０４（０８０（）０２９
化
ｉＯ广泛存在干人类的各种组织中包括成人和胎儿的肾脏中。ＮＳ
ｉＳ分布于正常肾叶间动脉，ＮＯ弓形动脉，肾小球，肾小管一些段落。
ｃＡ一１０细胞图像分析仪分析。ｌｓ００结果原位杂交结果显示：ＯｍＮ产生于胚胎１ｄ分布在输尿管芽；胎１ｄｉＳＲＡＮ４，胚６至成年ｉＯｍＮＮＳＲＡ主要分布在近曲小管，而远曲小管表达较少。各组ｉＯｍＮＮＳＲＡ呈持续表达，无明显差异。Ｗｓｒ－ｌ结果显示：Ｏ的光密度百分数ｅｔｎｂｔｅｏｉＳＮ在胚胎１ｄ最高，４组随肾脏发育ｉＯ含量逐渐减少，组差异有显著性。结论ＮＳ各

检测一氧化氮的荧光探针研究进展

第49卷第7期2021年4月广州化工Guangzhou Chemical IndustryVol.49No.7Apr.2021检测一氧化氮的荧光探针研究进展吴志文，张振涛(内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110)摘要：一氧化氮(NO)在许多生理病理过程中起着至关重要的作用，在各种分析NO方法中，基于荧光探针的图像技术由于其高灵敏度，无创性和可视化的独特优势被认为是理想的检测方法。

本文对邻苯二胺、芳香仲胺、二氢毗睫等有机物NO荧光探针和铜(II)、铁(III)的金属络合物的NO荧光探针，在合成设计、灵敏度、选择性及在体内外实时定量检测外源性和内源性NO 的应用，进行了综述介绍。

关键词：一氧化氮；荧光探针；有机物；金属络合物中图分类号：R914.5文献标志码：A文章编号：1001-9677(2021)07-0017-05 Research Progress on Fluorescent Probes for Detection of NOWU Zhi-wen,ZHANG Zhen-tao(Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Hohhot010110,China)Abstract:Nitric oxide(NO)plays a crucial role in many physiopathological processes,and among the various methods for NO analysis,the image technique based on fluorescent probes is considered ideal due to its unique advantages of high sensitivity,noninvasivenessand visualization.The application of NO fluorescent probes for organic NO such as o-phenylenediamine,aromatic secondary amines,and dihydropyridine and NO fluorescent probes for metal complexes of copper(II)and iridium(III)in terms of synthetic design,sensitivity,selectivity,and real-time quantitative detection of exogenous and endogenous NO in vitro and in vivo were reviewed.Key words：NO；fluorescent probes；organic matter；metal complexes一氧化氮(NO)是一种重要的气体分子，是通过三种不同的一氧化氮合酶(内皮型一氧化氮合酶eNOS；神经元一氧化氮合酶nNOS；诱导型一氧化氮合酶iNOS)将L-精氨酸转化为瓜氨酸而产生的⑴。

一氧化氮合酶的结构与功能研究及其临床应用

一氧化氮合酶的结构与功能研究及其临床应用一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种广泛存在于生物体内的气体分子，它可以通过一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的催化作用而产生。

NOS是一种含有赖氨酸二肽基（L-arginine）结构域的酶，可以将L-arginine和氧气通过多步反应转化成NO。

NOS作为一种重要的调节因子，参与了许多不同类型的生理和病理过程。

因此，对于了解NOS的结构与功能研究，以及在临床上的应用具有重要的意义。

一氧化氮合酶的结构与功能研究NOS是一种组成蛋白质复合物的酶，在哺乳动物中包括三种亚型：内源性神经型NOS（nNOS）、内源性内皮型NOS（eNOS）和外源性诱导型NOS（iNOS）。

nNOS主要存在于神经系统中，eNOS主要存在于内皮细胞中，iNOS是由细胞因子诱导而发生表达的酶。

这三种亚型的结构存在差异，但其催化界面和催化机制基本相同。

NOS的结构一般存在于C型柿蒂纳（Cys-Tyr-Ile-Asn-Val-Asp）结构域中，这个结构域由一个赖氨酸加上一个α-氨基酸序列以及红色的半胱氨酸组成。

NOS的活性中心位于这个C型柿蒂纳结构域上，这个活性中心与NADPH和FAD相关。

NADPH提供一些阴离子带负电荷，从而促成了NOS催化反应的进行。

FAD和赖氨酸谷氨酰酶一起工作，促进了L-arginine加氧生成NO的反应。

同时，在NOS的多亚基复合物结构中，NOS也通过亚基之间的物理交互和电子传递来进行调控和发挥其催化作用。

除了开展NOS的分子间相互作用和调控相关的研究外，研究人员也对NOS和NO的在生理和病理过程中的作用展开了广泛的研究。

例如，在神经系统方面，nNOS通过调节进一步与电生理过程和神经显现过程相关的蛋白质的表达而发挥作用。

在心血管系统方面，eNOS的催化产物NO可直接作用于血管内皮细胞，导致正常的血管舒张，扩张血管，提高血流动力学，同时可抑制血管收缩因素，从而起到对心血管疾病的治疗作用。

一氧化氮合酶阳性神经元在小鼠脑内的分布

ｍｄｌ．ｅｈｄ：ｅｏｓｒｅｈｉｔｉｕｉｎａｄｒｏｐｏｏｙｏＬｅＭｔｏｓＷｂｅｖｔｅｄｓｒｂｔｏｎｎｒｂｌｇｆＮＯＳｎｕｏｓｉｈｒｉｆａｕｔ［ＯＳｓｎｓｄｅｒｎｎｔｅｂａｎｏｄｌ？ＵｅｕｉｇＮＡＤＰＨｌ
性神经元在小鼠脑内的分布和形态结果：大脑皮质、状体、底前脑、仁核、丘脑和脑干等处有较多一氧在纹基杏下
化氮合酶阳性神经元的分布。结论：明ＮＯ中枢神经系统的诸多功能有关。表关键词脑；经元；织化学；鼠神组小
６７０３０７第三军医大学组织学与胚胎学教研室）
（川北医学院解剖学教研室，充南
摘要目的：究一氧化氨合酶（－ｓ）小鼠脑内的分布：方法：ＮＡＨ－研ｒｏ在，用ＤＰ黄递酶组织化学技术，察了ＮＯＳ阳观
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ＣＨＩＥＳＪＮＥＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＡＴＯＭＹＶｄ．５Ｎｏ１２０２．０２
解剖学杂志
２００２年２５卷１期
一
氧化氮合酶阳性神经元在小鼠脑内的分布
谢兴国蔡文琴张吉强李成仁
ｓｔａｔ，ｏｅｒｉａａｉ，ｍｙｄｌｕｌｉｈｐｔａａｕｎｒｉｔｍ．ｎｌｓｏＴｈｄｉｔｉｕｉｎｏｔｔｍ￣ｆｒｂａｎｂｓｌａｇａａｎｃｅ，ｙｏｈｍ￣ａｄｂａｎｓｅＣｏｃｕｉｎ：ｅｉｓｌｓｅｄｓｒｂｔｆｏｃｔａａｔｈｔＮＯａｅｉｖｌｅｎｍａｙｂａｎｆｎｅｏｋ．ｍｙｈｎｏｖｉｎｒｉｕｃｒｄｉ，Ｋｅｒｓｂｒｉ；ｅｍｎｈｓｏｈｍｉｒｍｏｓｙｗｏｄａｎｎｕｓｉｔｃｅｓｙ；ｕｅａｔ］ｉｄＳｉｎ

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小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一)
作者：刘霞包翠芬张晓明穆长征
【摘要】目的：对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。

方法：分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量，SPSS10.0统计软件包统计分析。

结果：新生组酶含量最高为100%,随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4%。

结论：这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。

【关键词】小鼠;肾;神经型一氧化氮合酶
一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。

肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。

NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〔1〕。

目前对肾发生发育过程中NO和NOS的研究还刚刚起步,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。

1材料和方法
1.1实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。

根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。

1.2主要试剂
nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。

1.3Westernblot步骤
各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。

取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm离心10min,留取上清液。

用Bradford 法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。

配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μlSDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。

取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。

将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用
溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。

与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min；再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释
度为1∶200)室温孵育1h,TBST溶液洗脱3次,每次至少5min；NBT/BCIP 显色；扫描电泳条带,输入电脑,用光密度分析软件分析电泳条带光密度。

1.4统计学分析
SPSS10.0统计软件包统计分析，组间比较采用q检验，以P0.05为有统计学意义，P0.01为有明显统计学意义。

2结果
生后小鼠肾脏发生发育不同阶段nNOS含量分析Westernblot电泳条带图显示新生小鼠nNOS含量最高，随着肾脏发生发育逐渐降低，到成年降低至最低水平。

光密度分析显示：以测得的nNOS最大量为1,计算各组nNOS表达相对含量（百分数）。

新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天进一步降低，到成年降至最低水平。

见表1。